3.2.1. Tạo mẫu nuô cấy vô trùng
- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng khác nhau đến hiệu quả khử trùng của mẫu nuôi cấy
+ Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của Nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu lá non nuôi cấy.
Hóa chất Công thức mt Nồng độ (%) Thời gian(phút) Số mẫu ban đầu Mẫu lá non Tỉ lệ mẫu đạt (%) Tỉ lệ mẫu không đạt (%) HgCl2 CT1 0,1 5 CT2 0,1 10 CT3 0,1 15 CT4 0,1 20 H2O2 CT5 5 10 CT6 10 10 CT7 15 10 CT8 20 10
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8.
+ Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu chồi đỉnh nuôi cấy
Hóa chất Công thức mt Nồng độ (%) Thời gian (phút) Số mẫu ban đầu Mẫu chồi đỉnh Tỉ lệ mẫu đạt (%) Tỉ lệ mẫu không đạt (%) HgCl2 CT1 0,1 5 CT2 0,1 10 CT3 0,1 15 CT4 0,1 20 H2O2 CT5 5 10 CT6 10 10 CT7 15 10 CT8 20 10
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8.
+ Thí nghiệm 1.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu đoạn thân.
Hóa chất Công thức mt Nồng độ (%) Thời gian(phút) Số mẫu ban đầu
Mẫu đoạn thân Tỉ lệ mẫu đạt(%) Tỉ lệ mẫu không đạt (%) HgCl2 CT1 0,1 5 CT2 0,1 10 CT3 0,1 15 CT4 0,1 20 H2O2 CT5 5 10 CT6 10 10 CT7 15 10 CT8 20 10
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8.
- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. - Mục đích của thí nghiệm: quan sát, so sánh và xác định được nguồn mẫu đưa vào tối ưu nhất từ thí nghiệm 1 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Nguồn mẫu Tỷ lệ sống(%) Nhận xét
Lá non Chồi đỉnh Đoạn thân
Môi trường nền chung: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8.
Thí nghiệm3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của mẫu nuôi cấy.
Mục đích của thí nghiệm: Xác định được môi trường nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Sử dụng nguồn mẫu được xác định thừ thí nghiệm trước.
Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng.
Công thức 1 (VW): Môi trường khoáng Vacin and Went (1949)
Công thức 2 (VW1): môi trường VW tăng gấp đôi lượng KNO3 và NH4SO4.
Công thức 3 (VW2): môi trườngVW1 bổ sung thêm vitamin của môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962).
Công thức 4 (MS/2): môi trường MS giảm đi 1 nửa.
Môi trường nền: 30 g/l Sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/l AC + 5,5 g/l agar, pH 5,8.
Loại môi trường tối ưu sẽ được chọn làm môi trường nền tối ưu (NTU) cho các thí nghiệm tiếp theo. Môi trường nền tối ưu ký hiệu là NTU.
Môi trường nền chung: NTU +30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH = 5,8.
- Thí nghiệm 4:Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy.
Mẫu được lựa chọn sinh trưởng trong loại môi trường được xác định là tốt nhất ở thí nghiệm 3.
Công thức 1 (B1) Nồng độ 6-BA bổ sung : 0mg/l môi trường Công thức 2 (B2) Nồng độ 6-BA bổ sung : 0,5mg/l môi trường Công thức 3 (B3) Nồng độ 6-BA bổ sung : 1mg/l môi trường Công thức 4 (B4) Nồng độ 6-BA bổ sung : 2mg/l môi trường Công thức 5 (B5) Nồng độ 6-BA bổ sung : 2,5mg/l môi trường Công thức 6 (B6) Nồng độ 6-BA bổ sung : 3mg/l môi trường Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8.
3.2.2. Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh thông qua protocorn ở các đ ều k ện nuô cấy khác nhau
Sau khi xác định môi trường tạo protocorm, tiến hành thu nhận protocorm với chất lượng cum xanh khỏe, không có hiện tượng thủy tinh hóa và mọng nước để tiến hành thí nghiệm này.
Công thức 1: 0mg/l 6-BA Công thức 2: 1mg/l 6-BA Công thức 3: 2mg/l 6-BA Công thức 4: 3mg/l 6-BA Công thức 5: 4mg/l 6-BA Công thức 6: 5mg/l 6-BA
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8.
- Thí nghiệm 6 : Đánh giá ảnh hưởng của 6-BA kết hợp với kinetin lên khả năng nhân protocorm.
Nồng độ 6-BA được xác định là tốt nhất cho quá trình nhân nhanh protocorm ở thí nghiệm 6 được sử dụng để đánh giá tiếp cho thí nghiệm 6. Mẫu được sử dụng từ thí nghiệm trên.
Công thức 1 :Nồng độ kinetin bổ sung : 0,0mg/l môi trường Công thức 2 :Nồng độ kinetinbổ sung : 0,1mg/l môi trường Công thức 3 :Nồng độ kinetinbổ sung : 0,2mg/l môi trường Công thức 4 :Nồng độ kinetinbổ sung : 0,3mg/l môi trường Công thức 5 :Nồng độ kinetinbổ sung : 0,4mg/l môi trường Công thức 6 :Nồng độ kinetin bổ sung : 0,5mg/l môi trường Môi trường nền chung: NTU + 6-BA(thí nghiệm 5) + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8.
3.2.3. Ngh ên cứu phương pháp tá s nh cây và tạo cây hoàn chỉnh
- Thí nghiệm7: Nghiên cứu môi trường tái sinh cây.
+Thí nghiệm 7.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 6-BA đến khả năng tái sinh và nhân chồi. Mẫu thu được từ các thí nghiệm tối ưu môi trường nhân nhanh protocorm được sử dụng cho các thí nghiệm trong giai đoạn này.
Công thức 2: 0,25mg/l 6-BA Công thức 3: 0,5mg/l 6-BA Công thức 4: 0,75mg/l 6-BA Công thức 5: 1mg/l 6-BA Công thức 6: 1,25mg/l 6-BA
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8.
+ Thí nghiệm 7.2: Ảnh hưởng của nồng độ kết hợp 6-BA và kinetin đến khả năng tái sinh và nhân chồi
Công thức 1: 0mg/l kinetin Công thức 2: 0,1mg/l kinetin Công thức 3: 0,2mg/l kinetin Công thức 4: 0,3mg/l kinetin Công thức 5: 0,4mg/l kinetin Công thức 6: 0,5mg/l kinetin
Môi trường nền chung: NTU + 6-BA (thí nghiệm 7.1) + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8
- Thí nghiệm 8 : Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro
+ Thí nghiệm 8.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của cây con in vitro. Lựa chọn cây con đã được tái sinh từ thí nghiệm 7 để làm vật liệu cho thí nghiệm này.
CT1: 0mg/l GA3 CT2: 0,1mg/l GA3 CT3: 0,2mg/l GA3 CT4: 0,3mg/l GA3 CT5: 0,4mg/l GA3 CT6: 0,5mg/l GA3 CT7: 1mg/l GA3
Môi trường nền chung: NTU + 6-BA( thí nghiệm 7.1) + kinetin (thí nghiệm 7.2) + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX+ 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8. + Thí nghiệm 8.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ của cây con in vitro. Sử dụng cây con cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 8.1 để làm vật liệu cho thí nghiệm này.
CT1: 0mg/l NAA CT2: 0,2mg/l NAA CT3: 0,4mg/l NAA CT4: 0,6mg/l NAA CT5: 0,8mg/l NAA CT6: 1mg/l NAA
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8.
+ Thí nghiệm 8.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước Dừa đến quá trình sinh trưởng của cây con in vitro.
Cây con cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 8.2 được sử dụng cho thí nghiệm này CT1: 0ml/l
CT2: 50ml/l CT3: 100ml/l CT4: 200ml/l
Môi trường nền chung: NTU + α-NAA (thí nghiệm 8.2) + 30 g/L sucrose + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8.
3.2.4. Nghiên cứu phương pháp huấn luyện và đưa cây in vitro ra ngoà vườn ươm vườn ươm
Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số biện pháp huấn luyện cây in vitro trong bình trước khi ra ngôi
Cây con thu thập được khi đã đạt được các chỉ tiêu về chiều cao, lá, rễ … tiến hành cho ra vườn ươm.
Công thức 1: Cây đưa từ in vitro ra ngôi ngoài vườn ươm ngay.
Công thức 2: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau lấy ra và đưa ra vườn ươm.
Công thức 3: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau đó mang ra nhà lưới 3 ngày trước khi ra ngôi.
Công thức 4: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau đó mang ra nhà lưới mở nắp bình 3 ngày trước khi ra ngôi.
Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể khác nhau lên tỷ lệ sống sót khi ra cây trong nhà lưới
Các loại giá thể thông dụng : CT1: vỏ thông
CT2: rong biển CT3: than củi
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm khởi tạo thể tiền chồi, nhân thể tiền chồi và tạo cây hoàn chỉnh từ thể tiền chồi được thử nghiệm trên các nền môi trường khác nhau bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và phụ gia như nước dừa và chuối xanh ở các hàm lượng khác nhau. Môi trường khoáng nuôi cấy được sử dụng là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), VW (Vacine and Went, 1949) và các môi trường nền phù hợp cho nuôi cấy hoa lan. Các thành phần môi trường khác gồm: đường sucroza, vitamin, chuối xanh, nước dừa và một số chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin, cytokinin và gibberelin với nồng độ thay đổi tùy theo mục đích của mỗi thí nghiệm. Mẫu lá non trong thí nghiệm tạo thể tiền chồi được cấy trên đĩa petri (10 cm x 2 cm), mẫu chồi đỉnh và đoạn thân được cấy vào ống nghiệm. Mẫu thực vật trong thí nghiệm nhân thể tiền chồi và tạo cây được cấy vào bình tam giác 250 ml. Mẫu thí nghiệm được nuôi ở điều kiện 25±1 oC, chiếu sáng 10 h/ngày ở cường độ ánh sáng 2000-2500 lux trên giá đèn huỳnh quang hoặc không chiếu sáng trong tủ nuôi có điều khiển nhiệt độ và ánh sáng của hãng SANYO (Osaka, Japan). Các thí nghiệm tối ưu hóa môi trường khởi tạo thể tiền chồi, nhân thể tiền chồi và tạo cây từ thể tiền chồi theo nguyên tắc tối ưu một biến. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần mỗi lần 5 bình mẫu. Đối với mẫu là protocorm đươc thực hiện với số lượng là 100 protocorm, còn mẫu đã là cây hoàn chỉnh thì tiến hành thí nghiệm 5 bình mẫu mỗi bình 5 cây. Các số liệu thu được được xử lý thống kê trên bảng tính Excel (Microsoft) và phần mềm IRRISTAT 5.0.
3.3.1. Giai đoạn chọn và xử lý mẫu
- Lá non:chọn những mẫulá non của cây lan trưởng thành sau đó rửa sạch bằng xà phòng, lau qua cồn 700 rồi tiến hành khử trùng mẫu.
- Chồi đỉnh: chọn các đỉnh sinh trưởng mọc từ chồi ở cây lan trưởng thành, mẫu được cắt dài khoảng 5cm sau đó mang đi rửa sạch bằng xà phòng, lau qua cồn 700 rồi tiến hành khử trùng mẫu.
- Đoạn thân: tiến hành lấy mẫu đoạn thân bánh tẻ mang mắt ngủ của cây lan trưởng thành dài khoảng 10cm, mang mẫu rửa sạch bằng xà phòng, lau qua cồn 700 rồi cắt thành từng đoạn và mang đi khử trùng mẫu.
3.3.2. Các hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
3.3.2.1. Hóa chất
- Hóa chất khử trùng : cồn, HgCl2, H2O2
- Môi trường nuôi cấy MS (Murashige& Skoog, 1962) và môi trường VW ( Vacin & Went, 1949)
-Shaccharose - Agar - Nước dừa - Chuối xanh
- Các chất kích thích sinh trưởng: 6-BA, Kinetin, α- NAA, GA3
3.3.2.2. Thiết bị
- Máy đo PH - Máy khuấy từ
- Cân phân tích 10-4 , cân kĩ thuật 10-2 - Bếp ga
- Lò vi sóng - Tủ sấy
- Nồi hấp vô trùng - Box cấy vô trùng
3.3.3. Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy in vitro
Môi trường cơ bản sử dụng trong nuôi cấy là: VW ( Vacin & Went, 1949), WV1 là môi trường WV tăng gấp đôi lượng KNO3 và NH4SO4, WV2 là môi trường WV1 bổ sung thêm vitamin của môi trường MS và môi trường 1/2 MS( môi trường MS giảm lượng đi một nửa). Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng là α- NAA, 6-BA, GA3 với các nồng độ khác nhau tùy theo từng thí nghệm. Chất chống oxi hóa và chất ngăn ngừa nhiễm là Rifamicine.
Thành phần môi trường: WV, WV1, WV2 và 1/2 MS.
Các chất bổ sung vào môi trường: dịch quả chuối xanh, 10% nước dừa, than hoạt tính, agar 5g/l, pH= 5,8.
Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ 23± 20C. Mẫu nuôi cấy tạo chồi trong điều kiện chiếu sáng 16h/ngày cường độ chiếu sáng 2000 -2500 lux. pH môi trường 5,8. Môi trường được khử trùng 20 phút với nhiệt độ 1170C.
3.4. CÁC CHỈ TIÊU THEO DÕI
- Giai đoạn vào mẫu:
Tỉ lệ sống: số mẫu sống/ tổng số mẫu cấy; Tỉ lệ chết: số mẫu chết/ tổng số mẫu cấy;
Tỉ lệ phát sinh hình thái: dạng Protocorm, dạng chồi. - Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Hệ số nhân: tổng số mẫu thu được/ tổng số mẫu ban đầu; Số chồi/ mẫu: số chồi thu được/ số mẫu cấy.
- Giai đoạn nhân nhanh
Hệ số nhân: tổng số mẫu thu được/ tổng số mẫu ban đầu; Số chồi/ mẫu: số chồi thu được/ số mẫu cấy;
Chất lượng chồi thu được.
- Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Tỉ lệ rễ/ chồi: tổng số tễ thu được/ tổng số chồi; Chiều dài trung bình rễ: tổng chều dài rễ/ số rễ; Chiều cao cây, số lá / cây, tỉ lệ ra rễ(%), và số rễ/ cây.
-Giai đoạn nuôi cấy ngoài vườn ươm:
Số lá/ cây;
Chiều dài lá, chiều rộng lá, số rễ, chiều dài rễ; Xuất hiện rễ mới sau bao nhiêu ngày;
Chiều cao cây, đường kính cây; Chiều dài rễ, đường kính rễ.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ẢNH HƯỞNG KHÁC NHAU CỦA CHẤT KHỬ TRÙNG ĐẾN MẪU NUÔI CẤY NUÔI CẤY
Bước khử trùng mẫu nuôi cấy là rất quan trọng để tạo ra được nguồn vật liệu vô trùng ban đầu. Khâu này được thực hiện thành công thì các bước tiếp theo mới có thể tiến hành được.Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khoáng và các chất điều hòa sinh trưởng. Đó cũng là môi trường thích hợp cho các loại nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ sinh trưởng của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với quá trình phân chia tế bào của thực vật. Nếu môi trường bị nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ trong vòng 3 – 7 ngày toàn bộ môi trường sẽ bị nhiễm, mẫu cấy sẽ chết dần. Vì vậy, để đảm bảo nuôi cấy được thành công thì mẫu phải được vô trùng tuyệt đối.
Trong nuôi cấy mô của đa số cây trồng, khi đưa mẫu từ ngoài vào trong ống nghiệm, người ta thường phải khử trùng mẫu nuôi cấy. Các chất khử trùng thông dụng nhất là oxy già (H2O2), clorua thuỷ ngân (HgCl2), hypochloride calcium (Ca(OCl)2), hypochloride natrium (NaClO) và một số chất kháng sinh ...v.v. Trong đó, HgCl2 có tác dụng diệt các loại khuẩn tốt hơn, H2O2 diệt nấm tốt hơn (Đỗ Năng Vịnh 2002; 2005). Vì vậy, tùy mẫu và điều kiện nuôi cấy để sử dụng chất khử trùng cho phù hợp.
Trong thí nghiệm nghiên cứu về ảnh hưởng của chất khử trùng đến quá trình vào mẫu của cây lan hoàng thảo Vôi Đỏ, chúng tôi tiến hành trên các đối tượng là lá non, đoạn thân và chồi đỉnh được lấy từ cây mẹ trưởng thành được nhập về hoàn toàn sạch bệnh và được khử trùng với chất khử trùng là H2O2 và HgCl2 ở các nồng độ và thời gian khác nhau. Kết quả khử trùng mẫu được theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy. Tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ chết là những chỉ tiêu được đánh