Phần 3 Đối tượng, vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm khởi tạo thể tiền chồi, nhân thể tiền chồi và tạo cây hoàn chỉnh từ thể tiền chồi được thử nghiệm trên các nền môi trường khác nhau bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và phụ gia như nước dừa và chuối xanh ở các hàm lượng khác nhau. Môi trường khoáng nuôi cấy được sử dụng là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), VW (Vacine and Went, 1949) và các môi trường nền phù hợp cho nuôi cấy hoa lan. Các thành phần môi trường khác gồm: đường sucroza, vitamin, chuối xanh, nước dừa và một số chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin, cytokinin và gibberelin với nồng độ thay đổi tùy theo mục đích của mỗi thí nghiệm. Mẫu lá non trong thí nghiệm tạo thể tiền chồi được cấy trên đĩa petri (10 cm x 2 cm), mẫu chồi đỉnh và đoạn thân được cấy vào ống nghiệm. Mẫu thực vật trong thí nghiệm nhân thể tiền chồi và tạo cây được cấy vào bình tam giác 250 ml. Mẫu thí nghiệm được nuôi ở điều kiện 25±1 oC, chiếu sáng 10 h/ngày ở cường độ ánh sáng 2000-2500 lux trên giá đèn huỳnh quang hoặc không chiếu sáng trong tủ nuôi có điều khiển nhiệt độ và ánh sáng của hãng SANYO (Osaka, Japan). Các thí nghiệm tối ưu hóa môi trường khởi tạo thể tiền chồi, nhân thể tiền chồi và tạo cây từ thể tiền chồi theo nguyên tắc tối ưu một biến. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần mỗi lần 5 bình mẫu. Đối với mẫu là protocorm đươc thực hiện với số lượng là 100 protocorm, còn mẫu đã là cây hoàn chỉnh thì tiến hành thí nghiệm 5 bình mẫu mỗi bình 5 cây. Các số liệu thu được được xử lý thống kê trên bảng tính Excel (Microsoft) và phần mềm IRRISTAT 5.0.
3.3.1. Giai đoạn chọn và xử lý mẫu
- Lá non:chọn những mẫulá non của cây lan trưởng thành sau đó rửa sạch bằng xà phòng, lau qua cồn 700 rồi tiến hành khử trùng mẫu.
- Chồi đỉnh: chọn các đỉnh sinh trưởng mọc từ chồi ở cây lan trưởng thành, mẫu được cắt dài khoảng 5cm sau đó mang đi rửa sạch bằng xà phòng, lau qua cồn 700 rồi tiến hành khử trùng mẫu.
- Đoạn thân: tiến hành lấy mẫu đoạn thân bánh tẻ mang mắt ngủ của cây lan trưởng thành dài khoảng 10cm, mang mẫu rửa sạch bằng xà phòng, lau qua cồn 700 rồi cắt thành từng đoạn và mang đi khử trùng mẫu.
3.3.2. Các hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
3.3.2.1. Hóa chất
- Hóa chất khử trùng : cồn, HgCl2, H2O2
- Môi trường nuôi cấy MS (Murashige& Skoog, 1962) và môi trường VW ( Vacin & Went, 1949)
-Shaccharose - Agar - Nước dừa - Chuối xanh
- Các chất kích thích sinh trưởng: 6-BA, Kinetin, α- NAA, GA3
3.3.2.2. Thiết bị
- Máy đo PH - Máy khuấy từ
- Cân phân tích 10-4 , cân kĩ thuật 10-2 - Bếp ga
- Lò vi sóng - Tủ sấy
- Nồi hấp vô trùng - Box cấy vô trùng
3.3.3. Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy in vitro
Môi trường cơ bản sử dụng trong nuôi cấy là: VW ( Vacin & Went, 1949), WV1 là môi trường WV tăng gấp đôi lượng KNO3 và NH4SO4, WV2 là môi trường WV1 bổ sung thêm vitamin của môi trường MS và môi trường 1/2 MS( môi trường MS giảm lượng đi một nửa). Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng là α- NAA, 6-BA, GA3 với các nồng độ khác nhau tùy theo từng thí nghệm. Chất chống oxi hóa và chất ngăn ngừa nhiễm là Rifamicine.
Thành phần môi trường: WV, WV1, WV2 và 1/2 MS.
Các chất bổ sung vào môi trường: dịch quả chuối xanh, 10% nước dừa, than hoạt tính, agar 5g/l, pH= 5,8.
Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ 23± 20C. Mẫu nuôi cấy tạo chồi trong điều kiện chiếu sáng 16h/ngày cường độ chiếu sáng 2000 -2500 lux. pH môi trường 5,8. Môi trường được khử trùng 20 phút với nhiệt độ 1170C.