Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4. Nguyên vât liệu
3.4.2. Các loại môi trường, hoá chất
* Các loại môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tuỳ tiện hay yếm khí tuỳ tiện. Điều kiện sinh trưởng tối ưu là 37oC, tuy nhiên vẫn sinh trưởng được ở 30 – 42oC. Vi khuẩn này sinh trưởng mạnh khi bổ sung thêm 5 – 10% máu cừu hoặc máu thỏ vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng sinh trưởng được trên môi trường tryptose soy agar và chocolate agar. Vi khuẩn không sinh trưởng trên các môi trường Macconkey agar, Endo agar. Các môi trường dạng lỏng cần được lọc kĩ như môi trường BHI, PB.
Môi trường ưu tiên sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn ORT là môi trường
thạch máu Columbia Blood Agar bổ sung 5% máu cừu hoặc máu thỏ và 5µg/ml
gentamycin (Asadpour et al., 2008).
Cách pha: cân chính xác 3,9g thạch máu Blood agar với 100ml nước cất và hấp ướt ở 121 oC trong 30 phút, để nguội 45 – 50 oC sau đó bổ sung 5ml máu thỏ lắc đều cho máu thỏ hoà tan trong thạch, màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn. Vì đã chứng minh được rằng hầu hết các ORT đều kháng gentamycin, nên cho thêm 10µg gentamycin cho mỗi ml môi trường thạch máu để có thể phân lập được ORT từ các mẫu bị tạp nhiễm. Sau đó đổ vào đĩa lồng (10 – 15 ml/ đĩa).
* Các loại hoá chất
- Hoá chất nhuộm Gram: tím Genxian, đỏ fucxin, cồn axetol 70 độ, dung dịch lugon.
- Thử phản ứng oxydase: giấy thử phản ứng oxydase tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p. Phenylenediamine hydrochloride.
- Thử phản ứng catalase: H2O2 3%
- Thử phản ứng indol: thuốc thử Kovac’s, nước trypton - Thử phản ứng KOH: dung dịch KOH 10%
- Thư phản ứng ure: canh thang ure
- Các loại đường: Succarose, maltose, glucose, lactose, fructose. - Thử kháng sinh đồ: môi trường thạch máu thỏ, giấy tẩm kháng sinh. - Kit QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN để chiết tách DNA.