Các mô, cơ quan như phổi, khí quản, túi khí được xem là tối ưu nhất khi sử dụng để phân lập được ORT. Ngoài ra, xoang dưới hốc mắt và hốc mũi cũng là những vị trí phù hợp phục vụ cho việc nuôi cấy. Nhưng, ORT dễ dàng bị bao phủ bởi sự phát triển quá nhanh của các vi khuẩn khác. Nuôi cấy vi khuẩn từ máu tim và mô của gan dưới các điều kiện thực tế cho kết quả âm tính, mặc dù trước đó vi khuẩn đã được phân lập từ các cơ quan cũng như ở các khớp xương, não, buồng trứng và ống dẫn trứng sau khi gây bệnh thực nghiệm (Karimi, V. et al., 2010).
ORT cũng có thể được phân lập một cách thông thường, trên thạch máu thường hoặc thạch chocolate (Charlton, B. R et al., 1993). Khuẩn lạc phát triển tốt trong 24 giờ, nhưng tốt nhất nên giữ các đĩa gây nhiễm từ 48 – 72 giờ trong điều kiện không khí làm giàu từ 7,5 – 10% CO2. Khuẩn lạc sẽ xuất hiện có kích thước như đầu đinh ghim hoặc nhỏ hơn (đường kính khoảng 1 – 2 mm), màu xám tới trắng, mặt lồi với cạnh sắc nét. Nhuộm Gram cho kết quả vi khuẩn Gram âm đa hình thái đặc trưng. Khuẩn lạc âm tính với catalase và dương tính với oxidase. Nuôi cấy ORT thuần khiết có mùi riêng biệt, tương tự như mùi acid butyric. Các thử nghiệm bổ sung là rất cần thiết để xác định các đặc tính của ORT (Charlton, B. R et al., 1993; Karrimi, V. et al., 2010).
Trong các mẫu bị tạp nhiễm với sự phát triển nhanh của các vi khuẩn khác như E.coli, Proteus sp hoặc Pseudomanas sp, khuẩn lạc của ORT có thể phát
triển quá mức và rất khó để xác định khi kiểm tra thường xuyên. Vì đã chứng minh được rằng hầu hết các ORT đều kháng Gentamycin, nên khuyến khích sử dụng 10µg Gentamycin cho mỗi ml môi trường thạch máu để có thể phân lập được ORT từ các mẫu bị tạp nhiễm. Thạch máu có chứa 5µg/ml gentamycin và polymixin B cũng cho hiệu quả tốt (Charlton, B. R et al., 1993).
Kiểm tra ngưng kết nhanh trên phiến kính cũng được sử dụng cho mục đích chẩn đoán. Trong một nghiên cứu với 112 mẫu phân lập, tuy nhiên hiện tượng tự ngưng kết thường xuất hiện (Ferreri, M., 2013; Charlton, B .R et al., 1993; Soriano, V. E et al., 2002).
Kiểm tra Accelerated Graphics Port (AGP) sử dụng kháng huyết thanh dương tính đã biết có thể được sử dụng để xác định và định type ORT đã phân lập (Charlton, B. R et al., 1993).
Một phương pháp khác được sử dụng để phát hiện các chủng phân lập nghi ngờ PCR.