Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3. Nội dung nghiên cứu
1) Tình hình mắc bệnh đường hơ hấp nói chung và bệnh ORT nói riêng trên đàn gà tại 4 tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hưng Yên.
+ Tình hình mắc một số bệnh đường hơ hấp tại 4 tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hưng Yên
+ Tình hình mắc một số bệnh đường hơ hấp theo lứa tuổi + Tình hình mắc một số bệnh đường hơ hấp theo mùa vụ + Tình hình mắc hoặc nghi mắc bệnh ORT tại 4 tỉnh
+ Nghiên cứu biểu hiện các triệu chứng lâm sàng và biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc bệnh ORT
2) Phân lập vi khuẩn ORT từ những gà mắc bệnh + Giám định vi khuẩn ORT bằng kĩ thuật PCR + Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn ORT
+ Xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn ORT ở một số cơ quan của gà mắc bệnh 3) Giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn ORT
4) Xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh
3.4. NGUYÊN VẬT LIỆU 3.4.1. Mẫu bệnh phẩm
- Gà và các mẫu bệnh phẩm nghi mắc bệnh ORT thu thập được như: phổi, hạnh phổi, khí quản, phế quản, mẫu Swab (dịch ngốy mũi, mắt, miệng, ổ nhớp, khí quản), lách, ruột, hạch…. Lấy ở các trang trại chăn nuôi gà ở Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hưng Yên.
3.4.2. Các loại mơi trường, hố chất
* Các loại môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tuỳ tiện hay yếm khí tuỳ tiện. Điều kiện sinh trưởng tối ưu là 37oC, tuy nhiên vẫn sinh trưởng được ở 30 – 42oC. Vi khuẩn này sinh trưởng mạnh khi bổ sung thêm 5 – 10% máu cừu hoặc máu thỏ vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng sinh trưởng được trên môi trường tryptose soy agar và chocolate agar. Vi khuẩn không sinh trưởng trên các môi trường Macconkey agar, Endo agar. Các môi trường dạng lỏng cần được lọc kĩ như môi trường BHI, PB.
Môi trường ưu tiên sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn ORT là môi trường thạch máu Columbia Blood Agar bổ sung 5% máu cừu hoặc máu thỏ và 5µg/ml gentamycin (Asadpour et al., 2008).
Cách pha: cân chính xác 3,9g thạch máu Blood agar với 100ml nước cất và hấp ướt ở 121 oC trong 30 phút, để nguội 45 – 50 oC sau đó bổ sung 5ml máu thỏ lắc đều cho máu thỏ hoà tan trong thạch, màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn. Vì đã chứng minh được rằng hầu hết các ORT đều kháng gentamycin, nên cho thêm 10µg gentamycin cho mỗi ml môi trường thạch máu để có thể phân lập được ORT từ các mẫu bị tạp nhiễm. Sau đó đổ vào đĩa lồng (10 – 15 ml/ đĩa).
* Các loại hố chất
- Hố chất nhuộm Gram: tím Genxian, đỏ fucxin, cồn axetol 70 độ, dung
dịch lugon.
- Thử phản ứng oxydase: giấy thử phản ứng oxydase tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p. Phenylenediamine hydrochloride.
- Thử phản ứng catalase: H2O2 3%
- Thử phản ứng indol: thuốc thử Kovac’s, nước trypton - Thử phản ứng KOH: dung dịch KOH 10%
- Thư phản ứng ure: canh thang ure
- Các loại đường: Succarose, maltose, glucose, lactose, fructose. - Thử kháng sinh đồ: môi trường thạch máu thỏ, giấy tẩm kháng sinh. - Kit QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN để chiết tách DNA.
3.4.3. Máy móc, giống vi khuẩn
- Tủ ấm, tủ -80 oC, kính hiển vi, máy ly tâm, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp gel, máy hấp ướt, tủ sấy khô, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ lạnh bảo quản môi trường…
- Giống vi khuẩn ORT
3.4.4. Dụng cụ
Dao, kéo, panh kẹp, khay, đèn cồn, eppendorf, lanmen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, ống nghiệm, đĩa lồng, pipet, dụng cụ bảo hộ….
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp quan sát các triệu chứng lâm sàng
Chúng tôi tiến hành theo dõi, quan sát và lấy mẫu gà trên các đàn gà nghi mắc ORT nuôi tại một số trại của Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hưng Yên; sau đó ghi chép các triệu chứng lâm sàng của gà nghi mắc ORT cịn sống. Gà có các triệu chứng như: ủ rũ, gà ngáp khó thở, đơi khi hắt hơi, vảy mỏ, mũi có dịch viêm, đau mắt…
3.5.2. Phương pháp mổ khám
Với những gà có triệu chứng rõ ràng, chúng tôi tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan theo quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú y.
Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết…).
Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại kí sinh trùng và các tổn thương…
Mổ khám kiểm tra nội tạng bên trong
Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm. Xử lý tiêu độc xác gia cầm.
3.5.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Các mẫu được lấy theo quy định của ngành.
Mẫu cơ quan tổ chức cần: lấy đúng cơ quan, đúng vùng tổn thương điển hình, lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cần thiết).
Mẫu có thể là dịch ngốy mũi, dịch hầu họng, dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi. Ta lấy mẫu theo phương pháp sau:
Đối với dịch ngoáy mũi và dịch ngốy hầu họng dùng tăm bơng vơ trùng ngoáy sâu vào lỗ mũi/ hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70o để một thời gian cho dịch thấm vào tăm bông ─> Để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển (Stuart TranspORT medium), môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS, đậy nút và ghi nhãn rồi đưa về phịng thí nghiệm sau sau 2-8h. Nếu ở xa phịng thí nghiệm thì mơi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh dương. Sau vận chuyển bệnh phẩm phải được cấy vào môi trường phân lập thích hợp.
Đối với dịch khí quản hay phế quản: dùng kéo vơ trùng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đó dùng tăm bông vô trùng đưa dọc theo đường ống để lấy dịch. Đặt tăm bông vào môi trường như trên, đậy nút, ghi nhãn và vận chuyển về phịng thí nghiệm.
Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm.
Với mẫu là tổ chức phổi bệnh: chỉ lấy mẫu đối với phổi có bệnh tích quan sát được bằng mắt thường, cách lấy như trên.
3.5.4. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là việc tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu nhằm mục đích đưa vi khuẩn về dạng thuần khiết. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là
giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Bằng cách phương pháp phân lập vi sinh vật sẽ phân lập được vi khuẩn thuần khiết để từ đó xác định một số đặc điểm sinh vật, hoá học gây bệnh của vi khuẩn.
Mẫu sau khi lấy về được cấy trên các môi trường thông thường và đặc biệt như: thạch máu thỏ 5-10%, nước thịt, thạch Chocolate. Nuôi cấy ở 37 oC trong 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ tuỳ loại vi khuẩn. Căn cứ vào tính chất mọc trên các mơi trường để chọn các khuẩn lạc riêng biệt. Với ORT tiến hành nuôi cấy trên môi trường thạch máu thỏ có bổ sung gentamycin 5% nuôi ở 37 oC trong 10 – 15 ngày thấy khuẩn lạc nhỏ, không dung huyết ra xung quanh, màu xám tới xám trắng đôi khi có màu đỏ hung, bờ mặt lồi với bờ rìa rõ ràng. Không mọc trên môi trường Macconkey.
Dựa vào sơ đồ phân lập:
Dịch ngoáy mũi của gà mắc ORT các lứa tuổi ↓
Nuôi cấy trên môi trường thạch máu thỏ
↓
Phân lập thuần khiết khuẩn lạc trên môi trường Columbia Blood Agar ↓
Nhuộm Gram, kiểm tra hình thái
↓
Kiểm định, định loại vi khuẩn bằng các đặc tính hình thái và sinh hố ↓
Cấy vào thạch giữ giống, trộn với 25% glycerol nguyên chất
3.5.5. Phương pháp nhuộm Gram
Dựa trên cơ sở sự khác biệt về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians khơng bị tẩy màu bởi ancolhol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím gentians cịn vi khuẩn Gram âm bắt mầu hồng của fucshin
Các bước tiến hành:
giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy 1 – 3 khuẩn lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào giọt nước để khô trong điều kiện tự nhiên. Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần để vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính và để vi khuẩn bắt mầu tốt hơn.
Bước 2: Nhuộm màu
Nhỏ dung dịch tím Gentians để n trong vịng 1 phút, rửa nước. Nhỏ dung dịch Lugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nước. Khử màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, để khô. Nhỏ tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nước, để khơ. Quan sát hình thái vi khuẩn được nhuộm ở vật kính dầu với độ phóng đại 100.
3.5.6. Phương pháp thử các đặc tính sinh hố của chủng vi khuẩn phân lập được được
Phản ứng thử Oxydase: sử dụng thuốc thử của hãng Remel. Tiến hành
trên giấy được tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p Phenylenediamine hydrochloride. Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch máu phết đều lên trên mặt giấy thấm thuốc thử. Trong vòng 10 giây đầu, nếu môi trường chuyển sang màu tím than, phản ứng cho kết quả dương tính. ORT cho hản ứng Oxidase dương tính.
Phản ứng Catalase: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường
thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên, trộn đều, nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính. ORT có phản ứng Catalase âm tính.
Phản ứng Indol: dùng để phát hiện vi khuẩn có enzyme trytophanasa
chuyển hoá trypton thành indol. Cấy vi khuẩn vào nước trypton và ủ ở 37oC/ 24 giờ. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s, phản ứng dương tính có vịng màu hồng cánh sen nổi lên trên (do indol kết hợp với p-dimethylaminnobelzal dehyde có trong thuốc thử Kovac’s), nếu khơng có màu hoặc màu vàng là phản ứng âm tính. ORT có phản ứng indol âm tính.
Phản ứng KOH: dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi trường thạch máu phết
lên phiến kính sạch đã có sẵn một giọt dung dịch KOH 10% đánh tan rồi nhấc que cấy lên. Nếu khuẩn lạc vón cục là phản ứng dương tính. Nếu khuẩn lạc khơng vón cục, tan ra và khơng tạo nhớt là phản ứng âm tính. ORT có phản ứng KOH âm tính.
Phản ứng phân giải Ure: phát hiện enzyme urease phân giải ure thành
ammonia và cacbodioxide. Amonia sinh ra làm kiềm hóa mơi trường. Cấy vi khuẩn vào canh thang ure, ủ 37OC/ 24 – 48 giờ. Phản ứng dương tính: mơi trường có mầu tím đỏ; phản ứng âm tính: khơng màu. ORT có phản ứng Ure dương tính.
3.5.7. Phương pháp PCR
3.5.7.1. Phương pháp chiết tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl Buffer
ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.
Bước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. Ủ ở 70oC trong 30 phút.
Bước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vịng/phút trong
1 phút. Loại bỏ dịch ở dưới.
Bước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1
phút, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút,
bỏ dịch dưới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.
Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong màng
lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 µl Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20oC.
3.5.7.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR Thành phẩn của phản ứng PCR: STT Nội dung Thể tích (µl) 1 Nuclease-Free Water 6,5 2 Master Mix 12,5 3 Reverse Primer 0,5 4 Forward Primer 0,5 5 DNA 5 Tổng 25
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
Giai đoạn Bước Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số vòng
1 Duỗi mạch 94 5 phút 1
2
Duỗi mạch 94 30 giây
45
Gắn mồi 52 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3 Hoàn chỉnh 72 7 phút 1
Dừng phản ứng 4
3.5.8. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được xác định bằng phương pháp kháng sinh đồ.
Chủng vi khuẩn kiểm tra được tăng sinh trong môi trường BHI, nuôi trong tủ ấm 37 oC, 5% CO2 trong vòng 24 – 48 giờ. Chuẩn bị đĩa thạch máu để tủ ấm 10 – 20 phút trước khi dùng. Lấy 0,1ml canh khuẩn cần kiểm tra nhỏ vào đĩa thạch và láng đều, sau đó để đĩa thạch từ 3 – 5 phút cho khơ nhưng khơng để q 25 phút. Sau đó dùng panh đặt và ấn nhẹ các khoang giấy đã tẩm các loại kháng sinh đặt cách nhau khoảng 15mm. Sau khi đặt các khoang giấy trên mặt thạch trong vòng 15 phút, lật úp đĩa thạch lại và đặt trong tủ ấm CO2 ở 37 oC. Đọc kết quả sau 24 – 48 giờ.
Dùng thước đo kích thước vịng vơ khuẩn (dùng thước đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp). So sánh kích thước vịng vơ khuẩn với bảng 3.1, sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm như là: nhạy cảm (H), trung bình (I) và kháng (R).
Nếu có hiện tượng khuẩn lạc mọc trong vịng ức chế thì đây có thể xuất hiện sự thay đổi tính kháng của vi khuẩn hoặc do các huyền dịch vi khuẩn bị trộn lẫn vào với nhau. Các khuẩn lạc này nên được nuôi cấy, phân lập và thử nghiệm lại tính nhạy cảm với kháng sinh.
Đo đường kính vịng vơ khuẩn xung quanh khoang giấy kháng sinh, đường kính được tính ra milimet. Đường kính này được chia thành các mức độ nhạy cảm, trung gian, đề kháng dựa vào bảng tiêu chuẩn theo hướng dẫn trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Bảng tiêu chuẩn của nhà cung cấp giấy tẩm kháng sinh
Tên thuốc Ký hiệu kháng sinh
Hàm lượng kháng sinh
(µg)
Đường kính vịng vơ khuẩn (mm)
R I H
Amoxcicilin/
Clavulanic acid AMC 20/10 <13 14 – 17 >18
Ampicilline AMP 10 <11 12 – 13 >14 Tetracycline TE 30 <14 15 – 18 >19 Lincomycin L 15 <15 15 – 17 >17 Cephalexin CE 15 <15 14 – 17 >16 Doxycilin DO 30 <13 14 – 16 >17 Erythromycin E 15 <13 14 – 22 >23
Ghi chú: H (High): mẫn cảm cao
I (Intermediate): mẫn cảm trung bình R (Resitant): kháng
Căn cứ vào tiêu chuẩn của từng loại kháng sinh để xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn:
- Vi khuẩn rất mẫn cảm với kháng sinh được đánh giá: +++ - Vi khuẩn mẫn cảm với kháng sinh: ++
- Vi khuẩn ít mẫn cảm với kháng sinh: +
Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán:
Phân lập trên môi trường thạch máu ↓
Cấy chuyển vào môi trường thạch máu ↓
Tạo huyễn dịch canh khuẩn trên đĩa thạch BHB ↓
↓ Khô mặt thạch Đặt khoanh kháng sinh
↓ Để tủ ấm 37oC có 10% CO2 Đo vịng vơ khuẩn
↓
Phân tích và trả lời kết quả
3.5.9. Phương pháp xư lý số liệu
Các kết quả thu được trong các thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Excel.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH MẮC BỆNH ĐƯỜNG HƠ HẤP TRÊN ĐÀN GÀ NĨI