Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.4. Phương pháp làm tiêu bản vi thể:
Chúng tôi sử dụng phương pháp làm tiêu bản tẩm đúc parafin theo Robert (1969), Burn (1974), cắt dán mảnh bằng máy cắt chuyên dụng, nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE).
rồi đúc thành hai block. Mỗi block được cắt, nhuộm tiêu bản, sau đó tiến hành soi dưới kính hiển vi để đọc kết quả bệnh tích vi thể. Nếu block nào có 2 tiêu bản có bệnh tích trở lên được coi là dương tính.
Quy trình làm tiêu bản: Các bước tiến hành
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: Lọ chứa formol 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37ºC, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48 – 52ºC, xylen, paraffin, thuốc nhuộm Hematoxylin – Eosin,…
- Lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm là gan, thận, lách,… - Cố định bệnh phẩm (mục đích để giết chết tổ chức).
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol).
- Vùi bệnh phẩm: Mục đích tạo ra các chất nền cho tổ chức dễ cắt.
+ Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 – 5mm. Đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ từ 12 – 24 giờ để rửa sạch formol.
+ Khử nước: Cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn Cồn I: 3 giờ
Cồn II: 3 giờ Cồn III: 3 giờ Cồn IV: 12 giờ
Mục đích để khử nước ra khỏi tổ chức.
+ Khử cồn: Cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen Xylen I: 4 giờ
Xylen II: 4 giờ Xylen III: 12 giờ
Mục đích để khử hết cồn ra khỏi tổ chức.
Yêu cầu: Khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được. Nếu để quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt.
sáp ong đã nấu, đảo nhiều lần thành môi trường đồng nhất ổn định, đặc chắc, không lẫn tạp chất, không bọt), gồm 3 lọ.
Parafin I: 6 giờ trong tủ ấm 56ºC Parafin II: 6 giờ trong tủ ấm 56ºC Parafin III: 12 giờ trong tủ ấm 56ºC
Mục đích để khử hết xylen trong tổ chức. Trong tổ chức chỉ còn paraffin thấm đều trong các kẽ mô bào.
Nếu nhiệt độ trên 56ºC thì miếng tổ chức sẽ giòn và dễ vỡ, khó cắt. - Đúc block
+ Mục đích: Đưa bệnh phẩm vào trong khối paraffin tạo thành một thể thống nhất.
+ Chuẩn bị: Máy đúc block, paraffin. + Phương pháp tiến hành:
Đặt miếng bệnh phẩm nằm vào chính giữa khuôn block, đổ nhanh paraffin lỏng vào khuôn block. Sau đó, đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. Để nguội đến khi block đông cứng, đặc chắc là được.
- Cắt tãi mảnh:
+ Chuẩn bị: Máy cắt, dao cắt, nước ấm 48 - 52ºC, phiến kính, pank kẹp… + Cắt mảnh: Cắt bằng máy microtom với độ dày khoảng 2 - 5µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
+ Tãi mảnh: Dùng pank kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt đều, lấy phiến kính hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48 - 52ºC rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính. Sau đó để ở tủ ấm 37ºC đến khi bệnh phẩm khô, nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm HE.
- Nhuộm tiêu bản: Bao gồm các bước sau:
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 cốc Xylen I: 15 - 30 phút
Xylen II: 15 - 30 phút Xylen III: 15 - 30 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 cốc Cồn 100ºC: 5- 10 phút
Cồn 95ºC: 5- 10 phút Cồn 80ºC: 5- 10 phút Cồn 60ºC: 5- 10 phút
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 5 - 10 phút
+ Nhuộm Hematoxylin (nhuộm nhân): Lau khô nước ở tiêu bản, nhỏ Hematoxylin ngập tiêu bản. Để trong khoảng 5 - 10 phút sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa sạch qua nước. Lau sạch nước quanh tiêu bản. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tím là được.
Nếu nhạt màu nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây).
Nếu đậm nhúng qua lọ cồn axit (cồn 96º + HCl 1%) trong 30 giây. + Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5 - 10 phút, tùy theo thực tế màu Eosin. Sau đó rửa nước chảy 5 - 10 phút cho hết Eosin thừa.
+Tẩy nước: Cho tiêu bản hai lọ cồn tuyệt đối, mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản đi qua hệ thống xylen I, xylen II sau đó cho vào xylen đã làm nóng trong tủ ấm 37ºC trong vòng 2 phút.
Gắn Baume canada:
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngoài.
+ Đánh giá kết quả:
Đem soi lên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khí là được.