Giai đoạn 1: giai đoạn biến tính, tất cả DNA mạch kép làm khuôn mẫu ban đầu hoặc sản phẩm mới được làm biến tính thành các mạch đơn bởi nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của các phân tử DNA, thường là 940C - 950C với thời gian 30 giây - 1 phút. Ở nhiệt độ này các liên kết hydro giữa các base của 2 mạch bổ sung bị phá hủy.
Giai đoạn 2: Giai đoạn lai, bắt cặp xảy ra khi nhiệt độ được hạ thấp đến nhiệt độ thích hợp (thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi 50C) và mồi sẽ bắt cặp với khuôn mẫu. Trong thực nghiệm nhiệt độ này trong khoảng 40 - 700C tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi sử dụng.
Giai đoạn 3: Giai đoạn tổng hợp kéo dài nhiệt độ được tăng lên 720C là nhiệt độ thích hợp nhất cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp. DNA polymerase kết hợp với phức hợp mồi - khuôn nhận các deoxyribonucleotidee tự do ngoài môi trường gắn vào đầu 3’của mồi và kéo dài sản phẩm Kidd and Ruano (1995).
Sản phẩm của PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNA được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose nồng độ 0,8%-2%,
Kỹ thuật điện di trên gel là hết sức quan trọng đối với người làm kỹ thuật di truyền, vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một đặc tính là các phân tử acid nucleic ở pH trung tính, chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi acid nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose hay các loại thạch đặc biệt khác, các phân tử acid nucleic tùy theo kích thước sẽ chuyển dịch với các tốc độ khác nhau: loại có phân tử lượng lớn chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ chuyển dịch nhanh hơn. Kiểu loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử acid nucleic, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel. Có hai loại gel được sử dụng phổ biến là agarose và polyacrylamid. Agarose được chiết xuất từ tảo biển, có thể mua ở dạng bột khô, bị nóng chảy ở nhiệt độ trên 450C, trong dung dịch đệm ở nồng độ thích hợp, thường trong khoảng 0,3-2,0% (w/v). Khi làm nguội (dưới 450C), agarose đông lại thành gel. Gel agarose thường được dùng để chạy trong máy điện di. Gel polyacrylamid thường được dùng để phân tách các phân tử acid nucleic có kích thước nhỏ hơn. Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó. Trạng thái đó được duy trì cho đến khi chất nhuộm đánh dấu (xanh Bromophenol) bổ sung vào mẫu trước khi đưa vào gel chạy tới đầu cuối của gel.
Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại. Kích thước các băng DNA được so sánh với chỉ thị di truyền DNA (DNA marker) được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR (Lê Thanh Hoà, 2002).
Theo (Vũ Minh Thục, 2004), nhược điểm chính của phương pháp PCR là sự nhạy cảm khác thường của chúng, làm cho chúng rất dễ có kết quả “dương tính sai” và thường diễn ra bởi một số lượng nhỏ DNA bị nhiễm chéo trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, riêng với bệnh dịch tả vịt Hansen et al. (1999) đã khẳng định sự đặc trưng của đoạn mồi đã được kiểm tra với bộ gen khuôn mẫu của các loại Herpesvirus gây bệnh ở gia cầm khác như đại bàng, chim câu, gà... Kết quả cho thấy sự khuếch đại vẫn không cho sản phẩm. Điều này có nghĩa là phản ứng này đặc hiệu rất cao cho DNA của virus dịch tả vịt. Với hai đoạn mồi sẽ có khả năng phát hiện 1 fg của DNA từ virus dịch tả vịt và phản ứng PCR được đánh giá là nhạy bén hơn gấp 20 lần so với việc chẩn đoán bệnh dịch tả vịt bằng nuôi cấy tế bào.
2.2.5. Biện pháp can thiệp và phòng bệnh Dịch tả vịt
2.2.5.1. Biện pháp can thiệp
Bệnh Dịch tả vịt là bệnh không chữa được. Tuy nhiên với đàn vịt mới chớm mắc vài con thì có thể can thiệp bằng cách vacxin nhược độc cho toàn đàn. Những vịt chưa bị nhiễm virus nặng sẽ được bảo hộ bằng hiện tượng cản nhiễm. Nếu tiêm sớm và kết hợp với chăm sóc đàn vịt tốt thì có thể cứu được tới 90% vịt (Trần Minh Châu, 1980). Nên tăng cường thêm các biện pháp chăm sóc bồi dưỡng nhằm tăng cường sức đề kháng cho vịt (sử dụng chất điện giải và vitamin).
2.2.5.2. Phòng bệnh
* Vệ sinh phòng bệnh
(Lê Hồng Mận, 2005) khuyến cáo: Không chăn vịt, ngan, ngỗng từ nơi có nhiều nguồn nước chảy tới để đề phòng sự lây nhiễm qua nguồn nước.
(Phạm Quang Hùng, 2003) nêu một số nguyên tắc phòng bệnh bằng vệ sinh như sau:
- Chuồng trại vịt cách xa khu dân cư. Cổng trại phải có hố sát trùng (thường sát trùng bằng Chloramin 3%). Hạn chế người đi lại, người ra vào trại phải sát trùng giày dép, tay chân.
- Điều kiện nuôi dưỡng tốt, máng ăn, máng uống phải sạch sẽ. Thức ăn, nước uống phải vệ sinh. Thực hiện tiêu độc, sát trùng dụng cụ, chuồng trại giữa hai lứa vịt. Chú ý tiêu diệt chuột và các loài gặm nhấm quanh khu vực trại.
- Vịt mới mua về phải nuôi cách ly ít nhất 3 tuần lễ. * Tiêm phòng bằng vacxin
-Vacxin vô hoạt:
Để vô hoạt virus Dịch tả vịt, trước đây thường dùng hoá chất là formol, gần đây sử dụng chất BPC (β propiolactone). Tại Việt Nam đã chế thử vacxin vô hoạt như: vacxin Dịch tả vịt gan máu glyxerin tím, vacxin formol gan. Theo OIE (2000) vacxin vô hoạt tạo được miễn dịch cho đàn vịt nhưng hiệu lực thấp hơn so với vacxin nhược độc, hiện nay vacxin vô hoạt chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng trong sản xuất.
- Vacxin nhược độc:
Ngày nay người ta thường sử dụng chủng virus vacxin là virus Dịch tả vịt nhược độc thích nghi trên phôi vịt và virus Dịch tả vịt chủng Jansen thích nghi trên phôi gà và trên nuôi tế bào Fibroblast phôi gà một lớp. Đây là 2 loại vacxin có độ an toàn cao và hiệu lực tốt, thời gian miễn dịch dài, sau khi tiêm vacxin 9 tháng vịt vẫn còn miễn dịch. Vacxin sử dụng an toàn với cả vịt con một ngày tuổi. Vacxin được chế biến dưới 2 dạng vacxin tươi và vacxin đông khô (Nguyễn Xuân Bình, 2003).
- Với đàn vịt ở vùng dịch bị uy hiếp, cần tiêm phòng cho vịt con ngay sau khi vịt nở.
- Vịt nuôi thịt chỉ cần tiêm phòng 1 lần. Ở nơi không bị dịch uy hiếp, có thể tiêm phòng cho vịt vào lúc vịt từ 2-3 tuần tuổi.
- Theo Quyết định số 63/2005/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn việc tiêm phòng vacxin bắt buộc đối với bệnh Dịch tả vịt gồm:
Đối tượng tiêm phòng: Vịt, ngan các lứa tuổi.
Phạm vi tiêm phòng: Các cơ sở chăn nuôi tập trung, chăn nuôi hộ gia đình trong phạm vi cả nước.
Tiêm phòng định kỳ mỗi năm 2 lần, tuỳ theo lứa tuổi.
Liều lượng, đường tiêm, gia cầm trong diện tiêm theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất vacxin.
2.3. VIRUS GÂY BỆNH DỊCH TẢ VỊT
Virus gây bệnh Dịch tả vịt là loại DNA virus thuộc họ Herpesvirideae nhóm Herpesvirus. Virus chỉ có một serotyp được biết đến nhưng có nhiều chủng có độc lực khác nhau tồn tại trong tự nhiên (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001). Theo Li et al. (2006) virus gây bệnh Dịch tả vịt có thể được phân loại vào phân họ Alphaherpesvirinae trong họ Herpesviridae.
2.3.1. Hình thái và kích thước
Nhìn qua kính hiển vi điện tử thấy virus dịch tả vịt có hình thái gần tròn, có lớp vỏ bọc bên ngoài và có một lõi ở giữa. Ở những tế bào được gây nhiễm virus, sau 24 giờ thấy các hạt vùi trong nhân và nguyên sinh chất. Đó là những tập hợp không có hình thù, trông giống như bụi. Trong nhân của những tế bào có hay không có thể vùi xuất hiện những khoảng trống, ở đó có những virus hoặc tập hợp virus có capxit hình cầu hoặc sáu cạnh Nucleocapxit có đường kính là 93,5 nm; Sau khi qua màng vào nguyên sinh chất đường kính của hạt virus tăng lên có thể đo được 136 nm và thành thục ở không bào với đường kính 250 nm (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
Virus Dịch tả vịt qua được lọc Chamberland, Berkefeld nhưng không qua được màng lọc Seitz. Bằng phương pháp lọc qua màng lọc; HESS (1968) đã nhận xét, virus Dịch tả vịt nhược độc chủng Jansen và virus cường độc có kích thước 150-250 nm.
2.3.2. Sức đề kháng
Theo (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001), Virus mẫn cảm với ether, chloroform. Cồn 750 diệt vi khuẩn trong 5 - 30 phút. Ở 220C NaOH 2%, NH4OH 0,5% cũng diết chết virus sau 30 phút. Virus ổn định ở pH từ 5 - 10 và bất hoạt khi pH < 3 và pH > 10.
Virus đề kháng kém với sức nóng: virus bị diệt ở 300C sau 2 giờ, ở 700C sau 20 phút; 800C trong 5 phút. Trong điều kiện lạnh -100C đến -200C virus có thể tồn tại hàng năm. Làm đông khô các chất chứa virus như máu, tim, gan, màng nhung niệu của phôi trứng vịt có thể giữ virus nhiều năm mà không mất hiệu lực.
Trong điều kiện tự nhiên, virus có thể tồn tại một thời gian khá dài tới 30 ngày OIE (2006) 5 ngày kể từ khi con vật cuối cùng chết vẫn có thể làm lây bệnh
2.3.3. Độc lực
Đã xác định được một số chủng virus dịch tả vịt có độc lực khác nhau: Hà Lan có chủng O độc lực mạnh nhất, sau đó đến các chủng W59, W60, N Jansen (1968).
Việt Nam có chủng 769, 880 có độc lực mạnh nhất, sau đó là các chủng NH, NB, C, T (Trần Minh Châu, 1987).
(Nguyễn Đức Hiền, 2005) phân lập một chủng virus gây bệnh Dịch tả vịt ở Cần Thơ và cho biết chủng virus này có độc lực cao, có khả năng gây bệnh và gây chết vịt ở phòng thí nghiệm khi tiêm bắp với liều 103ELD50/ml.
Năm 2005, tác giả Nguyễn Ngọc Điểm cũng đã phân lập thành công chủng virus cường độc Dịch tả vịt VG-2004. Qua bước đầu khảo sát đặc tính sinh học của chủng virus này tác giả cho biết virus dịch tả vịt chủng VG-2004 có độc lực mạnh hơn virus dịch tả vịt chủng 769 do tác giả Trần Minh Châu phân lập. 2.3.4. Đặc tính nuôi cấy
2.3.4.1. Nuôi cấy trên phôi
(Nguyễn Như Thanh và cs., 2001), nuôi cấy virus trên màng niệu đệm hoặc xoang niệu mô của thai vịt ấp 12 ngày, thai sẽ chết sau 4-6 ngày với các bệnh tích xuất huyết trên da vùng lưng, rìa cánh, đầu; gan và quả tối có điểm xuất huyết và hoại tử. Một số phôi có biểu hiện phù, một số phôi có hiện tượng màng nhung niệu sưng dày.
Virus Dịch tả vịt có thể cảm nhiễm với phôi ngỗng ấp 12 ngày tuổi và giết chết phôi sau 3-5 ngày. Virus cường độc Dịch tả vịt ít mẫn cảm ở những lần cấy truyền đầu tiên trên phôi gà. Đối với phôi gà 9-10 ngày tuổi phải tiếp truyền virus sau ít nhất 12 đời liên tiếp virus mới thích nghi.
Qua nhiều lần cấy truyền virus trên phôi vịt, phôi gà độc lực của virus sẽ giảm dần với vịt. Người ta sử dụng những chủng virus nhược độc này qua phôi gà, phôi vịt để chế tạo vacxin.
2.3.4.2. Nuôi cấy trên tế bào
Virus Dịch tả vịt có thể nuôi cấy trên môi trường tế bào phôi vịt, phôi gà một lớp và gây ra biến đổi bệnh lý cho tế bào Jansen (1968). Burgess and Yuill (1981) công bố virus Dịch tả vịt có khả năng nhân lên trên loại tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi ngan, gan phôi ngan, xơ phôi gà. Theo Ronald Atlanasio thì không quan sát thấy biến đổi bệnh lý tế bào khi nuôi cấy virus trên tế bào thận lợn dòng PK
15, tế bào WI-38, RD Hela, Hep-2, Vero, LleMK, BGM và BD (Trần Minh Châu, 1987).
Ở Việt Nam, khi nghiên cứu nuôi cấy virus cường độc trên tế bào xơ phôi vịt, sau 36 giờ có hiện tượng tế bào co tròn lại, thoái hoá và rụng khỏi thành bình tạo thành khoảng trống, xung quanh là những hợp bào (synciticum) như những dải đăng ten. Lớp tế bào này sẽ bị phá hủy hoàn toàn vào ngày thứ 4. Riêng đối với virus nhược độc chủng Jansen, virus rất thích ứng trên môi trường tế bào xơ phôi gà. Chỉ sau 24 giờ nuôi cấy virus, tế bào đã bắt đầu có hiện tượng hủy hoại. Tế bào bị biến dạng, co tròn, phình to ra, tập trung thành từng đám và có thể nhìn rõ dưới kính hiển vi quang học (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
Trong các bình nuôi cấy virus ở nồng độ loãng, có thể phát hiện được Plague (những ổ tế bào bị virus gây thoái hoá bằng cách nhuộm lớp tế bào với dung dịch fushin kiềm hoặc đỏ trung tính hoặc tím kết tinh (Nguyễn Lân Dũng và cs., 1972). Nếu nhuộm bằng fushin kiềm trong vài giây, sẽ quan sát thấy Plague hiện ra trên nền đỏ, hình tròn, bờ không gọn và có đường kính 1- 2 mm (Trần Minh Châu, 1987).
Theo HESS (1968) Plague của virus Dịch tả vịt cường độc hình tròn, to nhỏ không đều, có đường kính từ 1-8 mm. Plague của virus Dịch tả vịt nhược độc thì đều hơn, có bờ gọn và sáng, đường kính là 3-4 mm. (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001) mô tả, với các chủng virus nhược độc, Plague đều, gọn và sáng rõ, ở ngày thứ 3 có đường kính 3 mm, sau 6 ngày là 4-7 mm và sau 14 ngày sẽ là 10 mm.
2.3.4.3. Nuôi cấy trên động vật thí nghiệm
Có thể dùng vịt con 1 ngày tuổi để nuôi cấy virus. 3-12 ngày sau vịt chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh. Ngoài vịt con có thể dùng ngan con, ngỗng con, gà con mới nở để gây bệnh.
2.4. MIỄN DỊCH CHỐNG VIRUS DỊCH TẢ VỊT 2.4.1. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu
Khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của vịt đối với virus Dịch tả vịt thể hiện bằng sự sản sinh các chất miễn dịch không đặc hiệu, bao gồm: Interferon, Tế bào NK và các loại bổ thể có vai trò khởi phát viêm và opsonin hoá các yếu tố gây bệnh. Từ đó tạo điều kiện cho các tế bào thực bào bắt nuốt, tiêu diệt và trình diện kháng nguyên.
2.4.2. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu
2.4.2.1. Sự hình thành kháng thể kháng virus dịch tả vịt
* Miễn dịch chủ động tự nhiên
Sau khi vịt mắc bệnh Dịch tả vịt và đã khỏi bệnh thì vịt sẽ có kháng thể kháng virus Dịch tả vịt trong cơ thể. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả thì vịt khỏi bệnh có thể bị mắc trở lại. Bệnh tái phát thường ở thể ẩn, không có triệu chứng rõ. Nếu khám vịt ốm, chỉ thấy bên dưới lưỡi có nốt rộp, từ nốt rộp có tác giả đã phân lập được virus Dịch tả vịt.
* Miễn dịch chủ động nhân tạo
Vịt có được khả năng miễn dịch này nhờ được tiêm vacxin. Hiệu lực và độ dài đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại vacxin, đường đưa vacxin vào cơ thể,... Trên thực tế, khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn vịt khi sử dụng vacxin Dịch tả vịt vô hoạt thấp hơn khi dùng vacxin nhược độc. Việc tiêm nhắc lại nhiều lần hoặc tiêm nhắc lại với số lượng lớn kháng nguyên làm sản sinh ra một lượng kháng thể lớn hơn Friend and Pearson (1973).Về đường đưa vacxin, Shawky and Sandhu (1997) cho rằng đường đưa vacxin vào cơ thể tốt nhất là tiêm bắp hoặc tiêm dưới da.
* Miễn dịch bị động tự nhiên
Kháng thể của vịt mẹ được truyền cho vịt con qua lòng đỏ trứng. Lượng kháng thể Dịch tả vịt ở trong lòng đỏ cao hay thấp phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể trong huyết thanh vịt mẹ. Ở những vịt con một ngày tuổi, hàm lượng kháng thể Dịch tả vịt trong máu xấp xỉ bằng hàm lượng kháng thể trong lòng đỏ. Theo thời gian, hàm lượng kháng thể sẽ giảm dần và chỉ tồn tại ở vịt con tối đa là tới ngày 21. Ngoài ra, dù vịt con có được hưởng kháng thể từ vịt