Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.3. Virus gây bệnh dịch tả vịt
Virus gây bệnh Dịch tả vịt là loại DNA virus thuộc họ Herpesvirideae nhóm Herpesvirus. Virus chỉ có một serotyp được biết đến nhưng có nhiều chủng có độc lực khác nhau tồn tại trong tự nhiên (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001). Theo Li et al. (2006) virus gây bệnh Dịch tả vịt có thể được phân loại vào phân họ Alphaherpesvirinae trong họ Herpesviridae.
2.3.1. Hình thái và kích thước
Nhìn qua kính hiển vi điện tử thấy virus dịch tả vịt có hình thái gần tròn, có lớp vỏ bọc bên ngoài và có một lõi ở giữa. Ở những tế bào được gây nhiễm virus, sau 24 giờ thấy các hạt vùi trong nhân và nguyên sinh chất. Đó là những tập hợp không có hình thù, trông giống như bụi. Trong nhân của những tế bào có hay không có thể vùi xuất hiện những khoảng trống, ở đó có những virus hoặc tập hợp virus có capxit hình cầu hoặc sáu cạnh Nucleocapxit có đường kính là 93,5 nm; Sau khi qua màng vào nguyên sinh chất đường kính của hạt virus tăng lên có thể đo được 136 nm và thành thục ở không bào với đường kính 250 nm (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
Virus Dịch tả vịt qua được lọc Chamberland, Berkefeld nhưng không qua được màng lọc Seitz. Bằng phương pháp lọc qua màng lọc; HESS (1968) đã nhận xét, virus Dịch tả vịt nhược độc chủng Jansen và virus cường độc có kích thước 150-250 nm.
2.3.2. Sức đề kháng
Theo (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001), Virus mẫn cảm với ether, chloroform. Cồn 750 diệt vi khuẩn trong 5 - 30 phút. Ở 220C NaOH 2%, NH4OH 0,5% cũng diết chết virus sau 30 phút. Virus ổn định ở pH từ 5 - 10 và bất hoạt khi pH < 3 và pH > 10.
Virus đề kháng kém với sức nóng: virus bị diệt ở 300C sau 2 giờ, ở 700C sau 20 phút; 800C trong 5 phút. Trong điều kiện lạnh -100C đến -200C virus có thể tồn tại hàng năm. Làm đông khô các chất chứa virus như máu, tim, gan, màng nhung niệu của phôi trứng vịt có thể giữ virus nhiều năm mà không mất hiệu lực.
Trong điều kiện tự nhiên, virus có thể tồn tại một thời gian khá dài tới 30 ngày OIE (2006) 5 ngày kể từ khi con vật cuối cùng chết vẫn có thể làm lây bệnh
2.3.3. Độc lực
Đã xác định được một số chủng virus dịch tả vịt có độc lực khác nhau: Hà Lan có chủng O độc lực mạnh nhất, sau đó đến các chủng W59, W60, N Jansen (1968).
Việt Nam có chủng 769, 880 có độc lực mạnh nhất, sau đó là các chủng NH, NB, C, T (Trần Minh Châu, 1987).
(Nguyễn Đức Hiền, 2005) phân lập một chủng virus gây bệnh Dịch tả vịt ở Cần Thơ và cho biết chủng virus này có độc lực cao, có khả năng gây bệnh và gây chết vịt ở phòng thí nghiệm khi tiêm bắp với liều 103ELD50/ml.
Năm 2005, tác giả Nguyễn Ngọc Điểm cũng đã phân lập thành công chủng virus cường độc Dịch tả vịt VG-2004. Qua bước đầu khảo sát đặc tính sinh học của chủng virus này tác giả cho biết virus dịch tả vịt chủng VG-2004 có độc lực mạnh hơn virus dịch tả vịt chủng 769 do tác giả Trần Minh Châu phân lập. 2.3.4. Đặc tính nuôi cấy
2.3.4.1. Nuôi cấy trên phôi
(Nguyễn Như Thanh và cs., 2001), nuôi cấy virus trên màng niệu đệm hoặc xoang niệu mô của thai vịt ấp 12 ngày, thai sẽ chết sau 4-6 ngày với các bệnh tích xuất huyết trên da vùng lưng, rìa cánh, đầu; gan và quả tối có điểm xuất huyết và hoại tử. Một số phôi có biểu hiện phù, một số phôi có hiện tượng màng nhung niệu sưng dày.
Virus Dịch tả vịt có thể cảm nhiễm với phôi ngỗng ấp 12 ngày tuổi và giết chết phôi sau 3-5 ngày. Virus cường độc Dịch tả vịt ít mẫn cảm ở những lần cấy truyền đầu tiên trên phôi gà. Đối với phôi gà 9-10 ngày tuổi phải tiếp truyền virus sau ít nhất 12 đời liên tiếp virus mới thích nghi.
Qua nhiều lần cấy truyền virus trên phôi vịt, phôi gà độc lực của virus sẽ giảm dần với vịt. Người ta sử dụng những chủng virus nhược độc này qua phôi gà, phôi vịt để chế tạo vacxin.
2.3.4.2. Nuôi cấy trên tế bào
Virus Dịch tả vịt có thể nuôi cấy trên môi trường tế bào phôi vịt, phôi gà một lớp và gây ra biến đổi bệnh lý cho tế bào Jansen (1968). Burgess and Yuill (1981) công bố virus Dịch tả vịt có khả năng nhân lên trên loại tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi ngan, gan phôi ngan, xơ phôi gà. Theo Ronald Atlanasio thì không quan sát thấy biến đổi bệnh lý tế bào khi nuôi cấy virus trên tế bào thận lợn dòng PK
15, tế bào WI-38, RD Hela, Hep-2, Vero, LleMK, BGM và BD (Trần Minh Châu, 1987).
Ở Việt Nam, khi nghiên cứu nuôi cấy virus cường độc trên tế bào xơ phôi vịt, sau 36 giờ có hiện tượng tế bào co tròn lại, thoái hoá và rụng khỏi thành bình tạo thành khoảng trống, xung quanh là những hợp bào (synciticum) như những dải đăng ten. Lớp tế bào này sẽ bị phá hủy hoàn toàn vào ngày thứ 4. Riêng đối với virus nhược độc chủng Jansen, virus rất thích ứng trên môi trường tế bào xơ phôi gà. Chỉ sau 24 giờ nuôi cấy virus, tế bào đã bắt đầu có hiện tượng hủy hoại. Tế bào bị biến dạng, co tròn, phình to ra, tập trung thành từng đám và có thể nhìn rõ dưới kính hiển vi quang học (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
Trong các bình nuôi cấy virus ở nồng độ loãng, có thể phát hiện được Plague (những ổ tế bào bị virus gây thoái hoá bằng cách nhuộm lớp tế bào với dung dịch fushin kiềm hoặc đỏ trung tính hoặc tím kết tinh (Nguyễn Lân Dũng và cs., 1972). Nếu nhuộm bằng fushin kiềm trong vài giây, sẽ quan sát thấy Plague hiện ra trên nền đỏ, hình tròn, bờ không gọn và có đường kính 1- 2 mm (Trần Minh Châu, 1987).
Theo HESS (1968) Plague của virus Dịch tả vịt cường độc hình tròn, to nhỏ không đều, có đường kính từ 1-8 mm. Plague của virus Dịch tả vịt nhược độc thì đều hơn, có bờ gọn và sáng, đường kính là 3-4 mm. (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001) mô tả, với các chủng virus nhược độc, Plague đều, gọn và sáng rõ, ở ngày thứ 3 có đường kính 3 mm, sau 6 ngày là 4-7 mm và sau 14 ngày sẽ là 10 mm.
2.3.4.3. Nuôi cấy trên động vật thí nghiệm
Có thể dùng vịt con 1 ngày tuổi để nuôi cấy virus. 3-12 ngày sau vịt chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh. Ngoài vịt con có thể dùng ngan con, ngỗng con, gà con mới nở để gây bệnh.
2.4. MIỄN DỊCH CHỐNG VIRUS DỊCH TẢ VỊT 2.4.1. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu
Khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của vịt đối với virus Dịch tả vịt thể hiện bằng sự sản sinh các chất miễn dịch không đặc hiệu, bao gồm: Interferon, Tế bào NK và các loại bổ thể có vai trò khởi phát viêm và opsonin hoá các yếu tố gây bệnh. Từ đó tạo điều kiện cho các tế bào thực bào bắt nuốt, tiêu diệt và trình diện kháng nguyên.
2.4.2. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu
2.4.2.1. Sự hình thành kháng thể kháng virus dịch tả vịt
* Miễn dịch chủ động tự nhiên
Sau khi vịt mắc bệnh Dịch tả vịt và đã khỏi bệnh thì vịt sẽ có kháng thể kháng virus Dịch tả vịt trong cơ thể. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả thì vịt khỏi bệnh có thể bị mắc trở lại. Bệnh tái phát thường ở thể ẩn, không có triệu chứng rõ. Nếu khám vịt ốm, chỉ thấy bên dưới lưỡi có nốt rộp, từ nốt rộp có tác giả đã phân lập được virus Dịch tả vịt.
* Miễn dịch chủ động nhân tạo
Vịt có được khả năng miễn dịch này nhờ được tiêm vacxin. Hiệu lực và độ dài đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại vacxin, đường đưa vacxin vào cơ thể,... Trên thực tế, khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn vịt khi sử dụng vacxin Dịch tả vịt vô hoạt thấp hơn khi dùng vacxin nhược độc. Việc tiêm nhắc lại nhiều lần hoặc tiêm nhắc lại với số lượng lớn kháng nguyên làm sản sinh ra một lượng kháng thể lớn hơn Friend and Pearson (1973).Về đường đưa vacxin, Shawky and Sandhu (1997) cho rằng đường đưa vacxin vào cơ thể tốt nhất là tiêm bắp hoặc tiêm dưới da.
* Miễn dịch bị động tự nhiên
Kháng thể của vịt mẹ được truyền cho vịt con qua lòng đỏ trứng. Lượng kháng thể Dịch tả vịt ở trong lòng đỏ cao hay thấp phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể trong huyết thanh vịt mẹ. Ở những vịt con một ngày tuổi, hàm lượng kháng thể Dịch tả vịt trong máu xấp xỉ bằng hàm lượng kháng thể trong lòng đỏ. Theo thời gian, hàm lượng kháng thể sẽ giảm dần và chỉ tồn tại ở vịt con tối đa là tới ngày 21. Ngoài ra, dù vịt con có được hưởng kháng thể từ vịt mẹ, nhưng nếu bị nhiễm nhiều virus thì vẫn có thể bị chết vì bệnh Dịch tả vịt. Như vậy, kháng thể do vịt mẹ truyền cho chỉ có thể bảo vệ được vịt con trong những ngày đầu sau khi nở nếu chúng bị nhiễm một lượng virus rất ít Kulkarni et al. (1998).
* Miễn dịch bị động nhân tạo
Là trường hợp can thiệp vào đàn vịt (đã bị mắc bệnh Dịch tả vịt tự nhiên) bằng kháng thể dịch tả vịt. Tuy nhiên, việc tạo miễn dịch dạng này không tồn tại lâu trong cơ thể và cũng không mang lại nhiều ý nghĩa trong thực tiễn.
2.4.2.2. Các loại kháng thể chống virus Dịch tả vịt
* Kháng thể dịch thể:
Là các Globulin miễn dịch hoạt động chủ yếu khi virus còn ở ngoài tế bào như trong máu. Chúng phong bế sự hấp thụ virus với receptor tương ứng trên bề mặt tế bào, ngăn cản sự hòa màng giữa vỏ virus với màng tế bào và tiêu diệt bằng kết hợp kháng nguyên - kháng thể, có thể có sự tham gia của bổ thể. IgA hoạt động tại dịch tiết niêm mạc, diệt virus ngay tại hàng rào niêm mạc tại cửa ngõ cơ thể. Vai trò kháng thể dịch thể chống virus đặc biệt quan trọng trong giai đoạn sớm của quá trình nhiễm. Khi phức hợp kháng nguyên-kháng thể bị nuốt vào bên trong tế bào thực bào thì kháng thể đặc hiệu còn ngăn cản virus phá vỡ màng của hốc thực bào, phá mạng phân tử vỏ virus và ngăn không cho chúng tái sao được nữa.
Tính đặc hiệu khá cao của kháng thể dịch thể đã giúp cho việc xác định typ của chủng gây bệnh nhờ vào huyết thanh học. Hiệu quả của một số vacxin cũng nhờ vào cơ chế này. Nhưng đáp ứng dịch thể cũng bị hạn chế do chúng chỉ có tác dụng nếu xảy ra trong thời gian ngắn khi virus chưa ẩn mình trong tế bào; đôi khi chúng không có tác dụng tiêu diệt vì chúng chỉ chống lại những epitop không quan trọng của virus gây bệnh. Cụ thể trong thực nghiệm đã cho thấy các kháng thể này không gây nổi miễn dịch thụ động trên những con vật đã được mẫn cảm mà chỉ có kháng thể dịch thể (Vũ Triệu An, 1997). Trong miễn dịch dịch thể, hàm lượng kháng thể sinh ra nhiều hay ít phụ thuộc vào loại kháng nguyên được sử dụng, số lượng kháng nguyên, số lần được kích thích, và khả năng đáp ứng miễn dịch của con vật. Đối với bệnh Dịch tả vịt, lượng kháng thể dịch thể được sinh ra trong những trường hợp vịt bị nhiễm bệnh tự nhiên thường thấp và chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn. Vịt được tiêm vacxin nhược độc có kháng thể thấp còn vịt bị nhiễm virus cường độc thì hàm lượng kháng thể cao hơn.
* Miễn dịch tế bào:
Đáp ứng miễn dịch tế bào là phương thức bảo vệ chính của cơ thể chống lại virus thông qua những tế bào lympho độc Tc (hay CTL: Cytotoxic T Lymphocyte). Đa số các tế bào này mang dấu ấn CD8+ (Cluster of Differenciation 8+: glycoprotein bề mặt tế bào thường có trên tế bào Tc nhận biết phân tử MHC lớp I trên tế bào đích) và hoạt động theo cơ chế có hạn chế bởi
MHC (Major Histocompatibility Complex: phức hòa hợp mô - những phân tử có mặt trên tế bào làm nhiệm vụ trình diện kháng nguyên) nghĩa là chúng chỉ có tác dụng khi tế bào bị nhiễm mang cùng phân tử MHC I. Hầu hết các tế bào trong cơ thể đều có phân tử MHC I nghĩa là có thể bị Tc tấn công khi có nhiễm virus. Cơ chế hoạt động của CTL là gây chết tế bào bị nhiễm theo chương trình (apoptosis) đồng thời tiết cytokin như IFN (Interferon), TNF (Tumoz necrosin factor: yếu tố hoại tử u) để ức chế virus tái sao và hoạt hoá những tế bào khác tăng biểu lộ các phân tử MHC. Nhưng chính cơ chế này trong một số trường hợp lại gây ra một sự phá hủy tế bào rộng lớn hơn. Trong nhiều trường hợp sự phối hợp của cả hai đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch tế bào là nguyên nhân của trạng thái bệnh lý nặng nề. Guiping et al. (2007) bước đầu nghiên cứu về khả năng chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào lympho ở vịt đã kết luận rằng: Quá trình chết theo chương trình và hoại tử của tế bào lympho gây ra bởi sự tiêm truyền virus Dịch tả vịt dẫn đến sự phân hủy tế bào lympho. Sự chết theo chương trình của tế bào lỵmpho có thể đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của bệnh Dịch tả vịt.
Đáp ứng miễn dịch tế bào có vai trò quan trọng trong miễn dịch của cơ thể với virus Dịch tả vịt. Qua kết quả nghiên cứu của Jansen thấy rằng: Một số vịt sau khi được tiêm vacxin có hàm lượng kháng thể dịch thể rất thấp nhưng khi đem thử thách với virus Dịch tả vịt cường độc thì vẫn được bảo hộ. Jansen cho rằng trường hợp này rõ ràng có vai trò đáng kể của kháng thể tế bào và nhấn mạnh đến tầm quan trọng của việc dùng virus cường độc để thử hiệu lực vacxin.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
+ Đàn vịt nuôi mắc bệnh Dịch tả trên địa bàn huyện Thái Thụy tỉnh Thái Bình với số hộ điều tra đại diện là 250 hộ.
+ Địa điểm nghiên cứu các bệnh tích vi thể và chỉ tiêu huyết học: phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh lý – Khoa Thú Y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam..
+ Địa điểm lấy mẫu: một số hộ gia đình chăn nuôi có vịt mắc bệnh Dịch tả. 3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Thời gian: từ tháng 9/2016 đến tháng 7/2017. 3.3. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Vịt mắc bệnh dịch tả. (được chẩn đoán nhanh bằng phương phápPCR (Polymerase Chain Reactio.
- Máu của vịt mắc bệnh Dịch tả và vịt khỏe.
- Mẫu bệnh phẩm: Gồm các loại mẫu lấy từ cơ thể vịt mắc Dịch tả vịt bao gồm: gan, thận, lách, ruột…
- Dụng cụ, hóa chất:
+ Dụng cụ: Tủ lạnh, tủ sấy, tủ ấm 370C, tủ ấm 560C, máy đúc Block, khuôn đúc, máy cắt mảnh Microtom, kính hiển vi quang học, đũa thủy tinh, ống nghiệm, máy li tâm, vòng vớt, lam kính, la men, dao, pank, kẹp, cốc đựng hóa chất, đèn cồn, xylanh, kim lấy máu, buồng đếm Mc.Master.
+ Hóa chất: Nước cất, Formol 10%, thuốc nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE), cồn, xylen, paraffil đã nấu với sáp ong…
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Khảo sát tình hình chăn nuôi, tình hình dịch bệnh Dịch tả vịt trên đàn vịt nuôi tại huyện Thái Thụy tỉnh Thái Bình.
- Nghiên cứu một số triệu chứng lâm sàng chủ yếu của vịt mắc bệnh Dịch tả.
- Nghiên cứu một số bệnh tích đại thể của vịt mắc bệnh Dịch tả.
- Nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học của vịt mắc bệnh Dịch tả. 3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp điều tra và xác định bệnh
Điều tra, khảo sát đánh giá thực trạng tình hình bệnh Dịch tả vịt trên địa bàn nghiên cứu theo phương pháp phỏng vấn trực tiếp các hộ nuôi vịt, cán bộ thú y cơ sở thông qua phiếu điều tra, tổng hợp số liệu dịch bệnh được lưu trữ tại Chi cục Chăn nuôi và Thú y, Trạm Chăn nuôi và thú y huyện Thái Thụy.