3.3.1. Nguyên liệu nghiên cứu
- Mẫu ARN dương tính cúm type A của các mẫu dịch swab hầu họng lấy trên gà sống bán tại các chợ thuộc một số tỉnh Việt Nam.
- Dịch swab hầu họng của gà sống tại chợ thuộc một số tỉnh Việt Nam. - Mẫu bệnh phẩm phủ tạng gà nghi mắc cúm tại một số tỉnh Việt Nam. - Phôi trứng gà 9-11 ngày tuổi (lấy từ gà khỏe mạnh, chưa tiêm phòng vacxin CGC), tế bào xơ phôi gà chế từ phôi gà SPF 8 ngày tuổi.
- Tế bào dòng MDCK.
- Gà khỏe mạnh chưa tiêm phòng vacxin cúm gia cầm và không có kháng thể cúm gia cầm lấy từ cơ sở chuyên cung cấp động vật thí nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.
- Kít chiết tách RNeasy minikit (công ty Qiagen) và Kít realtime RT-PCR Invitrogen superscriptIII (công ty Invitrogen).
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu (TCVN 8400 -26: 2014)
a. Lấy mẫu
- Đối với gà đang sống, lấy mẫu dịch ngoáy họng, khí quản, lấy máu chắt huyết thanh.
- Đối với gà chết, mẫu cần lấy là: Khí quản, dịch khí quản; dịch rửa phế nang của phế quản; khí quản, phổi; các tổ chức phủ tạng khác: não, gan, lách, thận, tuyến tuỵ...
Bệnh phẩm sau khi lấy được cho vào dung dịch vận chuyển, có thể bảo quản ở 40C từ 1-2 ngày, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở nhiệt độ -700C.
b. Môi trường bảo quản bệnh phẩm
Bệnh phẩm là dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản được bảo quản trong dung dịch vận chuyển. Có thể sử dụng môi trường 199 hoặc môi trường glycerol có bổ sung kháng sinh, bảo quản ở 40C từ 1-2 ngày, nếu lâu nên giữ ở nhiệt độ -700C.
c. Phương pháp xử lý mẫu
- Dịch ngoáy khí quản, hậu môn: Bệnh phẩm được làm ấm, lắc mạnh ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc vortex mixer, bỏ tăm bông của ống dịch ngoáy, Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc 10 lần và lắc đều. Để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng. Mẫu đã sẵn sàng để tiêm truyền.
- Phủ tạng: Nghiền bệnh phẩm bằng cối chày sứ vô trùng thành huyễn dịch 10 % với dung dịch vận chuyển hoặc bằng PBS 0,01M pH = 7,2. Sau đó, bổ sung kháng sinh đậm đặc 10 lần theo tỉ lệ 1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm, chuyển sang ống ly tâm. Ly tâm với tốc độ 2.000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch nổi.
3.3.2.2. Phương pháp mổ khám toàn diện
Đối với những gà mắc cúm còn sống, quan sát triệu chứng lâm sàng và kiểm tra bệnh tích bên ngoài, trên da. Với những gia cầm gần chết hoặc đã chết có triệu chứng rõ ràng, tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích vi thể của tất cả các cơ quan theo quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú y (TCVN, 2010).
- Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết…)
- Người tham gia mổ khám phải mang đầy đủ các trang thiết bị bảo hộ đã được chuẩn bị trước.
- Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại ký sinh trùng và các tổn thương...
- Mổ khám kiểm tra bên trong.
- Nhúng ướt lông gia cầm bằng nước có pha dung dịch sát trùng.
- Đặt gia cầm nằm ngửa trên bàn mổ, dùng kéo hoặc dao cắt da giữa vùng bụng và bẹn ở hai bên chân, lật chân sang hai bên đồng thời kéo da bộc lộ hai cơ đùi. - Cắt da vùng giữa lỗ huyệt và xương lưỡi hái, một tay cầm hai chân tay kia cầm phần da trên xương hái kéo ngược chiều nhau lên tận vùng diều bộc lộ cơ ngực.
- Kiểm tra cơ ngực, cơ đùi, xương lưỡi hái về tình trạng khô cơ, xuất huyết, biến dạng...
- Dùng kéo hoặc dao rạch da từ phần diều lên tận phía dưới mỏ bộc lộ diều, thực quản, khí quản, tuyến Thymus để kiểm tra bên ngoài.
- Dùng kéo cắt ngang phần cơ giữa lỗ huyệt và xương lưỡi hái, cắt tiếp lên phía trên hai bên sụn sườn qua xương đòn, xương quạ, loại bỏ những tổ chức dính, nhấc bỏ xương lưỡi hái ra ngoài bộc lộ xoang bụng và xoang ngực.
- Quan sát các túi khí và phía ngoài các cơ quan nội tạng trong xoang bụng và xoang ngực.
- Lấy máu tim và các tổ chức nội tạng cho nuôi cấy xét nghiệm. - Lấy gan, mật, lá lách ra để kiểm tra màu sắc, kích thước, hoại tử.... - Kiểm tra tuyến tụy.
- Cắt đứt phía trên dạ dày tuyến, lật toàn bộ dạ dày, ruột ra phía sau để kiểm tra sau cùng tránh nhiễm bẩn dụng cụ và các tổ chức khác.
- Kiểm tra toàn bộ cơ quan sinh dục (buồng trứng, ống dẫn trứng, dịch hoàn, ống dẫn tinh).
- Kiểm tra thận, ống dẫn niệu
- Kiểm tra túi Fabricius bên ngoài và bên trong về hình dáng, kích thước, màu sắc, dịch.
- Dùng kéo mở một bên cạnh mỏ quan sát xoang miệng. Cắt ngang mỏ trên, kiểm tra xoang.
- Dọc thực quản thẳng tới diều kiểm tra dịch, chất chứa và mùi bên trong. - Dọc khí quản kiểm tra dịch, xuất huyết, hoại tử bên trong.
- Kiểm tra xoang bao tim, dịch bên trong, mở tim kiểm tra cơ, các xoang và van. - Tách phổi khỏi các xương sườn kiểm tra về màu sắc, độ xốp.
- Bộc lộ dây thần kinh cánh ở trước xương sườn thứ nhất, dây thần kinh hông ở trong cơ đùi hoặc trong xoang chậu dưới thận để kiểm tra sưng.
- Rạch khớp gối kiểm tra dịch, bẻ xương đùi kiểm tra độ cứng mềm, chẻ dọc xương đùi kiểm tra tuỷ.
- Cắt đầu gia cầm ở đốt sống atlas, lột da, dùng kéo cắt xương cắt sang hai bên từ lỗ chẩm đến cạnh trước xương đỉnh, lật hộp sọ bộc lộ não. Dùng kéo cong vô trùng tách màng não, cắt các dây thần kinh lấy não.
- Dùng kéo rạch ruột rạch từ dạ dày tuyến xuống hậu môn, kiểm tra các tổn thương, hoại tử, xuất huyết, ký sinh trùng…
- Dùng dụng cụ vô trùng lấy mẫu bệnh phẩm cho xét nghiệm trong phòng thí nghiệm.
- Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm. - Xử lý hấp tiêu độc xác gia cầm.
3.3.2.3. Phương pháp phân lập trên phôi trứng gà
- Phương pháp phân lập như sau (TCVN, 2010): Bệnh phẩm là dịch swab (ngoáy ổ nhớp của gà) của gà được xử lý bằng cách lắc ống dịch swab có tăm bông bên trong, rồi ly tâm sau đó chuyển dịch nổi sang ống 1,5 ml và vô trùng bằng kháng sinh hoặc lọc vô trùng qua màng lọc vô trùng 0,45µm.
- Bệnh phẩm là phủ tạng: Nghiền bệnh phẩm bằng cối chày sứ vô trùng thành huyễn dịch 10 % với dung dịch vận chuyển hoặc bằng PBS 0,01M pH = 7,2. Chuyển sang ống ly tâm, ly tâm với tốc độ 2.000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch nổi. Vô trùng bằng lọc qua màng lọc vô trùng 0,45µm.
- Sử dụng phôi trứng gà sạch 9-11 ngày tuổi.
- Tiêm 0,2 ml dịch bệnh phẩm (dịch swab hoặc dịch nghiền phủ tạng) vào xoang niệu mô của phôi trứng gà, tiếp tục ấp ở nhiệt độ 370C đến 96 giờ, soi trứng hàng ngày, thu trứng chết và cả trứng không chết đến ngày theo dõi cuối cùng và kiểm tra bằng phản ứng HA để xác định khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà và phản ứng HI với kháng thể chuẩn kháng virus cúm gia cầm và kháng thể chuẩn kháng virus Newcastle để giám định virus phân lập được.
- Phôi trứng được giữ ở tủ mát 2 – 80C ít nhất 2 giờ trước khi thu hoạch dịch niệu mô. Dùng syringe 5 ml hoặc 10 ml thu dịch niệu mô bằng cách đâm
xuyên qua nắp buồng hơi. Dịch niệu mô được chia thành nhiều ống nhỏ (0,5 ml/ống) giữ ở nhiệt độ -700C.
- Bố trí thí nghiệm xác định đặc tính phát triển của virus trên môi trường phôi trứng gà:
+ Lô thí nghiệm: liều tiêm: 200 µl huyễn dịch bệnh phẩm/phôi trứng. Số lượng phôi trứng: 3- 5 phôi trứng/ mẫu.
+ Lô đối chứng: liều tiêm 200 µl PBS/phôi trứng.
Số lượng phôi trứng: 3 - 5 phôi trứng/ mẫu.
Theo dõi quan sát hàng ngày, loại bỏ trứng chết, cất trứng chết ở 40C, mổ trứng kiểm tra hiệu giá HA. Cứ 24 giờ, một lượng dịch niệu mô được thu, kiểm tra hiệu giá HA để đánh giá khả năng phát triển của virus.
3.3.2.4. Xác định chỉ số EID50, TCID50
a. Chỉ số EID50(FAO, 2002)
- Để tính EID50, virus được pha loãng thành nhiều nồng độ theo cơ số 10 (ví dụ 10-1, 10-2….10-9) và tiêm vào xoang niệu mô của phôi trứng (0,1ml/phôi/5 phôi), ấp ở tủ ấp 370C tới 96 giờ.
- Soi trứng hàng ngày để kiểm tra phôi sống và phôi chết, thu các trứng chết và trứng sống, thu hoạch nước trứng. Thực hiện phản ứng HA đối với nước trứng. Mẫu nào có phản ứng HA dương tính, được coi là nhiễm virus A/H9N2. Sử dụng công thức Reed- Muench để xác định chỉ số EID50 của virus.
b. Chỉ số TCID50(FAO, 2002)
- Sử dụng môi trường tế bào xơ phôi gà chế từ phôi trứng gà 8 ngày tuổi (hoặc tế bào dòng MDCK) để chuẩn độ virus cúm gia cầm. Tế bào được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng (lượng tế bào là 5 x104 tế bào/100 µl/giếng). Virus được pha loãng theo các nồng độ 10-2….10-9 với môi trường Eagle’s MEM , mỗi nồng độ 5 giếng, mỗi giếng 100 µl dung dịch virus đã pha loãng ở các nồng độ đã xác định. Quan sát CPE và kiểm tra HA sau 2 ngày. Sử dụng công thức Reed- Muench để tính chỉ số TCID50 của virus. Cách tính TCID50 cũng giống với cách tính EID50.
c. Phương pháp Reed-Muench
Sử dụng bảng tổng hợp số liệu (Bảng 3.1) để tính toán chỉ số EID50 hoặc TCID50.
Giá trị EID50 và TCID50 được tính ở hiệu giá pha loãng cận trên 50% cộng với chỉ số tính được ở trên. Ví dụ nếu tính được chỉ số là 0,5 với độ pha loãng virus cao nhất có tỷ lệ nhiễm 50% là 107, thì chuẩn độ của virus sẽ là 107,5.
Bảng 3.1. Bảng tổng hợp số liệu tính toán theo phương pháp Reed-Muench
-Bố trí thí nghiệm xác định đặc tính sinh trưởng trên môi trường tế bào: + Lô thí nghiệm: liều nhiễm: 200 µl huyễn dịch bệnh phẩm/chai T25 chứa 5 ml dung dịch MEM.
Số lượng tế bào: 3 - 5 chai/mẫu.
+ Lô đối chứng: liều nhiễm 200 µl PBS/ chai T25 chứa 5 ml dung dịch MEM. Số lượng tế bào: 1 chai/mẫu.
Theo dõi quan sát hàng ngày, loại bỏ trứng chết, cất trứng chết ở 40C, mổ trứng kiểm tra hiệu giá HA. Cứ 24h, một lượng dịch tế bào được thu kiểm tra hiệu giá HA để đánh giá khả năng phát triển của virus.
3.3.2.5. Phương pháp xác định chỉ số độc lực của virus (IVPI) Xác định chỉ số IVPI (OIE, 2015) thực hiện như sau Xác định chỉ số IVPI (OIE, 2015) thực hiện như sau
- Kiểm tra kháng thể cúm gia cầm trước khi gây bệnh (công cường độc) bằng phương pháp Elisa, chỉ sử dụng gia cầm không có kháng thể kháng virus cúm gia cầm.
- Kiểm tra gà không nhiễm một số bệnh khác như Gumboro, viêm phế quản truyền nhiễm, Newcastle.
- Bố trí thí nghiệm như sau:
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm xác định chỉ số độc lực của virus (IVPI)
Nhóm gà Số con Liều tiêm Ghi chú
Thí nghiệm 10 106 EID50 (100 µl/con) Tiêm qua đường tĩnh mạch và nuôi cách ly 2 nhóm gà thí nghiệm Đối chứng 3 100 µl PBS/con
- Theo dõi trong vòng 10 ngày để đánh giá độc lực của virus bằng chỉ số điểm lâm sàng trung bình. (Theo phương pháp của OIE, virus được đánh giá là có độc lực cao-HPAI nếu điểm lâm sàng trung bình lớn hơn 1,2).
- Lấy mẫu dịch ngoáy hầu họng và ổ nhớp của tất cả các gà sống và chết vào các ngày 3, 7 và 10 sau khi gây nhiễm virus, xét nghiệm cúm A/H9N2 bằng phương pháp RRT-PCR để xác định mức độ bài thải virus của gà.
- Các gà chết được mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm não, phổi – khí quản, tim, gan, lách, thận, ruột - tụy và lông xét nghiệm cúm A/H9N2 bằng phương pháp RRT-PCR để đánh giá khả năng đa nhiễm các cơ quan của virus.
- Cho điểm lâm sàng gia cầm thí nghiệm như sau:
Chỉ tiêu đánh giá Điểm số
Bình thường 0 điểm
Ốm nhẹ (có biểu hiện 1 trong các triệu chứng bệnh) 1 điểm Ốm nặng (có biểu hiện từ 2 triệu chứng bệnh trở lên) 2 điểm
Chết 3 điểm
Triệu chứng bệnh sau khi nhiễm virus cúm: các dấu hiệu về hô hấp, ủ rũ, ỉa chảy, tím tái dưới da, phù mặt hoặc phù đầu, các dấu hiệu về thần kinh.
Sau đó cộng điểm từng ngày của mỗi gia cầm thí nghiệm và tính trung bình trên số ngày thí nghiệm. Có thể tính tiếp trung bình cho cả lô thí nghiệm.
Ví dụ:
Ngày sau tiến hành thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 TB
Điểm gia cầm TN 0 0 1 2 3 3 1,5
3.3.2.6. Phương pháp HA (OIE 2012)
- Phương pháp HA: tiến hành phản ứng trên đĩa microtiter 96 giếng đáy V (tổng lượng hỗn dịch phản ứng là 75µl/giếng).
+ Cho 25 µl dung dịch PBS pH 7,2 vào các giếng của đĩa phản ứng;
+ Cho 25 µl dung dịch chứa virus (nước trứng) vào giếng thứ nhất và bắt đầu pha loãng kháng nguyên virus theo cơ số 2 từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11;
+ Nhỏ 25 µl dung dịch PBS vào các giếng từ 1đến giếng thứ 12;
+ Nhỏ 25 µl dung dịch hồng cầu gà 1% (lấy từ gà trống khỏe mạnh) vào các giếng từ giếng 1-12. Để 15-30 phút ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả ngưng kết;
+ Hiệu giá ngưng kết hồng cầu gà (HA) là nồng độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ngưng kết toàn phần.
3.3.2.7. Phát hiện virus bằng phản ứng Realtime RT-PCR
a. Chiết tách ARN của virus gia cầm A/H9N2 bằng kít Qiagen RNeasy minikit.
Trình tự các bước Chuẩn bị
Chuẩn bị dung môi RLT (600µl/mẫu) vào ống ly tâm 50ml. Thêm 1/100 β- Mercaptoethanol (β-ME) vào dung môi RLT.
Dung môi này có thể bảo quản 1 tháng ở nhiệt độ phòng. Tiến hành tách chiết
- Lắc vortex mẫu trong 15 giây và ly tâm nhanh (spin down).
- Cho 600 µl dung môi RLT đã bổ sung β- ME vào ống eppendorf 1,5 ml. - Chuyển 200 µl mẫu sang ống 1,5 ml.
- Lắc vortex trong 15 giây và ly tâm nhanh .
- Cho 400 µl cồn tuyệt đối 100%, và lắc vortex trong 15 giây. - Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. - Đặt ống cột lọc (spin column) vào hệ thống hút chân không. - Chuyển tất cả dung dịch mẫu sang cột lọc và bật máy hút. Rửa lần 1
- Cho 700 µl dung môi RW1 vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi hút hết lượng mẫu trong cột lọc.
Rửa lần 2
- Cho 500µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi hút hết lượng mẫu trong cột lọc.
- Cho tiếp 500 µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi hút hết lượng mẫu trong cột lọc.
- Đặt cột lọc vào ống thu mới (collection tube).
- Ly tâm cột lọc với tốc độ 12000 vòng phút trong 2 phút. Thu ARN
- Chuyển cột lọc sang ống 1.5ml eppendorf mới.
- Cho 50-100µl nước (ARNse-free H2O) vào cột lọc, đợt 1 phút. - Ly tâm 1 phút ở tốc độ >10.000 phòng/ phút.
- Chuyển mẫu ARN đã thu sang ống 1.5ml mới. Cất giữ ARN
Có thể giữARN ở 40C trong vài giờ nếu xét nghiệm ngay. Cất giữ ở nhiệt độ -200C nếu chưa dùng ngay trong ngày để bảo quản ARN.
b. Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR (RRT-PCR)sử dụng primer và probe thiết kế đặc hiệu cho virus cúm gia cầm A/H9N2.
Bảng 3.3. Trình tự primer và probe phát hiện virus cúm gia cầm A/H9N2
Gen Primer/Probe Chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu
5’ 3’
M
Mồi xuôi 1 GACCRATCCTGTCACCTCTGAC