phôi trứng gà
Theo kết quả ở phần 4.4.4 chúng ta đã thấy môi trường để virus cúm gia cầm A/H9N2phát triển tốt nhất là môi trường phôi trứng gà 9-11 ngày tuổi.Vì vậy để xác định lại đặc tính thích ứng và ổn định của virus cúm A/H9N2, chúng tôi đã nuôi cấy nhân giống 3 đời virus trên môi trường phôi trứng gà 9 ngày tuổi. Các chủng virus ban đầu được pha loãng ở 10-2 rồi gây nhiễm trên trứng với lượng 200 µl/phôi trứng. Nuôi dưỡng và theo dõi trứng trong 4 ngày, sau đó thu hoạch dịch niệu mô, kiểm tra hiệu giá HA để xác định sự có mặt của virus cúm A/H9N2, chia các tube tương ứng cho mỗi đời virus, sau đó bảo quản ở -800C và xác định hiệu giá virus EID50 cho mỗi đời virus. Sự thích nghi của virus cúm A/H9N2 được đánh giá là ổn định khi liều EID50 ổn định. Kết quả được trình bày ở bảng 4.8 và hình 4.10.
Bảng 4.8. Kết quả xác định hiệu giá các chủng virus cúm A/H9N2 qua các đời nuôi cấy (10x EID50/ml)
Chủng virus Ký hiệu
virus
Hiệu giá virus (10x EID50/ml) Đời nuôi cấy P1 Đời nuôi cấy P2 Đời nuôi cấy P3 A/ck/VN/H7F-14-CB4- 18/2014(H9N2) CB4-18 8 8,13 8,13 A/ck/VN/H7F-14-LC4- 183/2014(H9N2) LC4-183 8,5 8,5 8,5 A/ck/VN/H7F-14-BN4- 339/2014(H9N2) BN4-399 8,63 8,63 8,63 A/ck/VN/NCVD- 15A53/2015(H9N2) 15A53 8,83 8,63 8,83 A/ck/VN/H7F-14-HG4- 413/2014(H9N2) HG4-413 8,5 8,63 8,63 Kết quả ở bảng 4.8 và hình 4.10 cho thấy: Với chủng virus cúm A/ck/VN/H7F-14-CB4-18/2014(H9N2) hiệu giá virus đạt 108 EID50/ml ở đời nuôi cấy P1, 2 đời nuôi cấy P2 và P3 đều có hiệu giá virus đạt 108,13 EID50/ml. Chủng virus A/ck/VN/H7F-14-LC4-183/2014(H9N2) ở cả 3 đời nuôi cấy P1, P2, P3 đều có hiệu giá virus là 108,5 EID50/ml. Với chủng virus A/ck/VN/H7F-14- BN4-339/2014(H9N2) hiệu giá virus cũng đạt 108,63 EID50/ml trên cả 3 đời nuôi cấy. Chủng virus A/ck/VN/NCVD-15A53/2015(H9N2) đạt hiệu giá virus ở đời
nuôi cấy P2 là 108,63 EID50/ml và đạt hiệu giá virus cao nhất ở 2 đời nuôi cấy P1 và P3 là 108,83 EID50/ml. Với chủng virus cúm A/ck/VN/H7F-14-HG4- 413/2014(H9N2) hiệu giá virus đạt 108,5 EID50/ml ở đời nuôi cấy P1 và hiệu giá virus đạt cao hơn ở 2 đời nuôi cấy P2, P3 là 108,63 EID50/ml.
Kết quả này cho thấy giữa các đời nuôi cấy nhân giống của 5 chủng virus cúm A/H9N2 không có sự chênh lệch đáng kể về hiệu giá virus và các chủng virus đều có hiệu giá virus tương đối cao.
Như vậy virus cúm A/H9N2 là tương đối thích nghi và ổn định qua các đời nuôi cấy nhân giống trên môi trường phôi trứng gà 9-11 ngày tuổi.
Hình 4.10. Hiệu giá các chủng virus cúm A/H9N2 qua các đời nuôi cấy 4.4. XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC CỦA VIRUS CÚM A/H9N2 PHÂN LẬP TRÊN GÀ TẠI VIỆT NAM
4.4.1. Xác định chỉ số độc lực qua tiêm tĩnh mạch - IVPI
Để đánh giá độc lực của virus cúm A/H9N2 chúng tôi chọn chủng virus A/ck/VN/NCVD-15A53/2015(H9N2) phân lập từ phủ tạng gà chết nhiễm cúm A/H9N2 có nguồn gốc từ Hà Nội để tiến hành thí nghiệm. Thí nghiệm đánh giá độc lực của virus cúm A/H9N2 được thực hiện trên gà 6 tuần tuổi với số lượng 10 gà thí nghiệm và 3 gà đối chứng.
Trước khi tiến hành thí nghiệm 1 ngày, tất cả gà được lấy máu, chắt huyết thanh để kiểm tra kháng thể cúm gia cầm nói chung bằng phương pháp ELISA
và mẫu swab để kiểm tra virus cúm gia cầm nói chung cùng một số bệnh khác như Gumboro, Newcastle, viêm thanh quản truyền nhiễm. Kết quả kiểm tra xác định tất cả động vật tham gia thí nghiệm đều âm tính với kháng thể cúm, virus cúm nói chung và các bệnh Gumboro, Newcastle, viêm thanh quản truyền nhiễm, đảm bảo đủ điều kiện tham gia thực hiện thí nghiệm đánh giá độc lực virus cúm gia cầm A/H9N2.
Gà được đánh số: 1-10 là lô gây nhiễm, 11-13 là lô đối chứng để theo dõi chi tiết từng con. Lô thí nghiệm mỗi con được gây nhiễm bằng đường tiêm tĩnh mạch với liều 106 EID50/100 µl/gà.Lô thí nghiệm được tiêm nước muối sinh lý và nuôi cách ly với lô thí nghiệm.Theo dõi gà trong 10 ngày, tính điểm lâm sàng, lấy swab hầu họng và ổ nhớp vào các ngày 3, 7 và 10 sau khi gây nhiễm. Đối với gà chết lấy swab hầu họng, ổ nhớp và mổ khám thu các tổ chức não, tim, phổi - khí quản, gan, lách, thận, ruột – tụy và lông để tiến hành xét nghiệm virus cúm A/H9N2 bằng phương pháp Realtime RT-PCR.Kết quả theo dõi đánh giá độc lực của virus cúm A/H9N2được thể hiện ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả đánh giá độc lực của virus cúm gia cầm A/H9N2 trên gà thí nghiệm
Lô KH
gà
Điểm biểu hiện lâm sàng Điểm
lâm sàng TB (IVPI) Ngày 1-3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8-10 Trung bình Thí nghiệm 1 0 0 1 3 3 3 1,6 0,52 2 0 0 1 1 0 0 0,2 3 0 3 3 3 3 3 2,1 4 0 0 0 0 0 0 0,0 5 0 0 0 0 0 0 0,0 6 0 1 3 3 3 3 1,9 7 0 0 0 0 0 0 0,0 8 0 1 1 0 0 0 0,0 9 0 0 1 1 0 0 0,0 10 0 1 1 1 1 0 0,0 Đối chứng 11 0 0 0 0 0 0 0,0 12 0 0 0 0 0 0 0,0 13 0 0 0 0 0 0 0,0
Theo tiêu chí đánh giá về độc lực của virus cúm gia cầm của Tổ chức Thú y thế giới-OIE (OIE Terrestrial Manual 2015) bằng phương pháp tiêm truyền tĩnh mạch – IVPI, nếu một virus cúm có điểm lâm sàng trung bình của lô thí nghiệm lớn hơn 1,2 thì virus đó sẽ được coi là virus cúm độc lực cao.
Kết quả ở bảng 4.9 cho thấy chủng virus A/ck/VN/NCVD- 15A53/2015(H9N2) sau khi gây nhiễm lên gà bằng đường tĩnh mạch có điểm lâm sàng trung bình đạt 0,52. Như vậy virus cúm A/H9N2 phân lập được trên gà tại Việt Nam là chủng virus cúm có độc lực thấp.
Ngoài ra mỗi gà trong thí nghiệm đều được theo dõi và tính điểm lâm sàng để đánh giá tình trạng nhiễm bệnh của từng cá thể, kết quả được trình bày ở hình 4.11.
Hình 4.11. Kết quả đánh giá điểm lâm sàng trên từng cá thể gà sau 10 ngày thí nghiệm
Kết quả hình 4.11 cho thấy trong 10 ngày theo dõi sau khi gây nhiễm virus, tại lô thí nghiệm có 7/10 gà có triệu chứng bệnh cúm được tính điểm lâm sàng cho mỗi cá thể. Trong đó có 3 gà sau 10 ngày theo dõi có điểm lâm sàng cao nhất (lớn hơn 1,2) là gà số 1, số 3 và số 6 (màu đỏ) cũng chính là những gà chết sau khi nhiễm virus cúm A/H9N2.Những gà này đều có biểu hiện ốm và chết từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 6 sau khi gây nhiễm virus. Điều này chứng tỏ 3 cá thể gà này bị bệnh với mức độ như khi nhiễm virus cúm độc lực cao.
Đồng thời 4 gà có điểm lâm sàng thấp (nhỏ hơn 1,2) là gà số 2, số 8, số 9 và số 10 (màu xanh). Những gà này có triệu chứng ốm nhẹ như ủ rũ, mệt mỏi kéo
dài từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 8 sau khi gây nhiễm, cuối cùng hồi phục lại bình thường sau 10 ngày thí nghiệm. Điều này cho thấy 4 cá thể gà này bị bệnh ở mức độ nhiễm virus cúm độc lực thấp.
Số gà còn lại trong lô thí nghiệm là gà số 4, số 5 và số 7 không có bất kỳ triệu chứng bệnh sau 10 ngày theo dõi.
Lô đối chứng hoàn toàn khỏe mạnh bình thường.
Hình 4.12. Một số hình ảnh gà sau khi gây nhiễm virus cúm A/H9N2trong thí nghiệm xác định độc lực
4.4.2. Đánh giá mật độnhiễm virus cúm A/H9N2 trên các cơ quan phủ tạng Theo một số tác giả, virus cúm gia cầm có khả năng tác động đến nhiều cơ Theo một số tác giả, virus cúm gia cầm có khả năng tác động đến nhiều cơ quan khác nhau trong cơ thể động vật bị nhiễm gọi là khả năng nhiễm đa phủ tạng. Vì vậy để đánh giá virus cúm gia cầm A/H9N2 có khả năng gây nhiễm đa
phủ tạng không chúng tôi thực hiện việc thu thập mẫu phủ tạng (não, tim, phổi - khí quản, gan, lách, thận, ruột – tụy và lông) của gà chết trong thí nghiệm, nghiền với PBS pH=7,2thành huyễn dịch 10%, sau đó xét nghiệm bằng phương pháp Realtime RT-PCR phát hiện gen H9/HA của virus cúm A/H9N2.Phản ứng Realtime PCR có thể tính toán tương đối chính xác lượng virus có trong mẫu xét nghiệm, vì vậy chúng tôi đã chuyển đổi kết quả xét nghiệm rRT- PCR sang chuẩn độ virus trên phôi trứng (log10 EID50) dựa trên hiệu giá virus đã biết sau khi chuẩn độ trên phôi trứng để đánh giá chi tiết hơn về mức độ nhiễm virus của từng loại phủ tạng. Như đã nêu trên, chúng tôi thu thập 8 loại cơ quan khác nhau của 3 gà chết trong thí nghiệm để đánh giá khả năng nhiễm đa phủ tạng, kết quả chi tiết được trình bày ở bảng 4.10 và hình 4.13.
Kết quả bảng 4.10 và hình 4.13 cho thấy bằng phương pháp rRT-PCR có 29,16% các mẫu phủ tạng thu thập được trên 3 gà chết sau gây nhiễm có kết quả dương tính với virus cúm gia cầm A/H9N2. Tuy nhiên giữa các mẫu khí quản khác nhau có mức độ nhiễm virus khác nhau:
Phổi – khí quản là cơ quan nhiễm virus nhiều nhất với hiệu giá virus trung bình là 6,43±1,36 log10EID50 (giá trị Ct trung bình là 23,34±4,26).
Não là cơ quan nhiễm virus nhiều thứ 2 sau phổi với hiệu giá virus trung bình là 4,44 ± 1,71 log10 EID50 (giá trị Ct trung bình là 29,62 ± 5,37).
Tại các cơ quan là tim, gan, lách, thận, ruột và tụy sự có mặt của virus ở mức rất thấp. Hiệu giá virus dao động trên dưới 1 log10 EID50.
Đặc biệt trong lông của 3 gà chết sau gây nhiễm virus hoàn toàn không phát hiện thấy virus cúm gia cầm A/H9N2.
Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi khá tương tự với nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc (Yuan et al., 2015) về mức độ nhiễm virus cúm H9N2 trên các cơ quan phủ tạng sau khi gây nhiễm cho thấy lượng virus phát hiện ở phổi là cao nhất so với các cơ quan phủ tạng khác như tim, gan, lách…
So sánh nghiên cứu này với nghiên cứu của Guo và các cộng sự (Guo et al., 2000) cũng cho kết quả tương tự về hiệu giá virus trên tổ chức phổi nhiều hơn trên tổ chức não gà sau khi gây nhiễm virus cúm H9N2.
Bảng 4.10. Kết quả xác định virus cúm A/H9N2 trên một số phủ tạng gà gây nhiễm và chuyển đổi sang hiệu giá virus
Gà
Não Phổi -khí
quản Tim Gan Lách Thận Ruột - Tụy Lông
Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10
1 34,90 2,76 27,69 5,05 40,00 1,15 40,00 1,15 38,42 1,65 40,00 1,15 33,88 3,09 40,00 1,15 3 24,17 6,17 19,17 7,76 36,65 2,21 40,00 1,15 40,00 1,15 37,72 1,87 40,00 1,15 40,00 1,15 6 29,80 4,38 23,17 6,49 38,88 1,50 38,85 1,51 40,00 1,15 40,00 1,15 40,00 1,15 40,00 1,15 TB 29,62 4,44 23,34 6,43 38,51 1,62 39,62 1,27 39,47 1,32 39,24 1,39 37,96 1,80 40,00 1,15 Std 5,37 1,71 4,26 1,36 1,71 0,54 0,66 0,21 0,91 0,29 1,32 0,42 3,53 1,12 0,00 0,00 Chú thích: TB: trung bình Std: độ lệch chuẩn
Hình 4.13. Hiệu giá virus ở các cơ quan phủ tạng qua phương pháp rRT- PCR (log10)
Ngoài ra khi so sánh kết quả nghiên cứu này với các kết quả nghiên cứu về virus cúm độc lực cao A/H5N1 của các nhà khoa học Đài Loan (Lee et al., 2007) thấy có sự khác nhau hoàn toàn về mức độ nhiễm virus gây ra trên gà khi gây nhiễm virus A/H5N1 là virus xuất hiện trên khắp các cơ quan phủ tạng của gia cầm chết sau khi gây nhiễm.
Kết quả này cũng khác với kết quả đánh giá độc lực của virus cúm A/H5N1 clade 7 trên gà do Nguyễn Tùng và cộng sự thực hiện(Nguyễn Tùng và cs., 2011)ở điểm phổi là cơ quan nhiễm nhiều virus H9N2 nhất sau đó là tổ chức não trong thí nghiệm gây nhiễm H9N2 còn trong thí nghiệm gây nhiễm H5N1 của
Nguyễn Tùng và cs. Thì não lại là cơ quan nhiễm nhiều virus nhất sau đó là tổ
chức phổi.
Mặc dù hiệu giá virus cúm H9N2 của các cơ quan phủ tạng sau khi lây nhiễm là thấp và khác nhau nhưng vẫn chứng tỏ virus này có tính hướng đa tổ chức.
Phổi xuất huyết Não sung huyết
Khí quản xuất huyết và chứa dịch nhầy
Tuyến tụy xuất huyết
Hình 4.14. Một số hình ảnh bệnh tích mổ khám gà chết sau khi gây nhiễm virus cúm A/H9N2
Đồng thời virus phân bổ nhiều ở tổ chức phổi – khí quản có thể dẫn đến những ảnh hưởng về hô hấp làm giảm sức đề kháng của con vật dễ kéo theo các bệnh đường hô hấp như hen. Bên cạnh đó virus mặc dù có phát triển ở tổ chức não nhưng không nhiều nên không gây ra những triệu chứng về thần kinh và những triệu chứng toàn thân như virus cúm thể độc lực cao, từ đó gia cầm nhiễm virus không có biểu hiện bệnh lý nặng dẫn đến tử vong cấp tính, đây cũng là minh chứng cho thí nghiệm gà chết ít.
4.4.3. Đánh giá mức độ bài thải virus trên gà gây nhiễm
Cùng với việc theo dõi hàng ngày đánh giá điểm lâm sàng trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm xác định độc lực của virus cúm A/H9N2, chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu dịch ngoáy hầu họng và dịch ngoáy ổ nhớp (swab) của những gà lô thí nghiệm chết hoặc sống vào ngày thứ 3, ngày thứ 7 và ngày thứ 10 sau khi gây nhiễm để đánh giá độ bài thải của virus ở các thời điểm khác nhau. Các mẫu swab này được bảo quản trong dung dịch đệm PBS (1 ml), sau đó xét nghiệm bằng phương pháp Realtime RT- PCR. Kết quả được trình bày ở hình 4.15.
Hình 4.15. Mức độ bài thải virus cúm A/H9N2
Kết quả hình 4.15 cho thấy trên cả 2 loại mẫu dịch swab kiểm tra là hầu họng và ổ nhớp chỉ phát hiện thấy virus cúm A/H9N2 trên loại mẫu swab hầu họng gà gây nhiễm, không phát hiện thấy virus cúm này trên mẫu swab ổ nhớp của gà trong thời gian 10 ngày theo dõi.
Trong 3 thời điểm lấy mẫu dịch swab gà là ngày 3, ngày 7 và ngày 10 sau gây nhiễm để đánh giá sự bài thài của virus cúm A/H9N2 trong thí nghiệm này thì ngày thứ 3 sau khi gây nhiễm là thời điểm gà bài thải virus nhiều nhất. Và sau 7 ngày gây nhiễm gà dừng việc bài thải virus cúm A/H9N2.
Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự như kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản (Nomura et al., 2012) về con đường bài thải virus H9N2 sau khi gây nhiễm trên gà cho thấy virus chỉ xuất hiện trên mẫu dịch ngoáy hầu họng, không thấy sự có mặt của virus trên mẫu dịch ngoáy ổ nhớp gà sau 10 ngày gây nhiễm.
So sánh với kết quả nghiên cứu của Guo và cộng sự (Guo et al., 2000) về thời gian bài thải virus, chúng tôi thấy thí nghiệm này có kết quả tương tự là sau 7 ngày gây nhiễm gà bắt đầu dừng bài thải virus ra bên ngoài qua đường hầu họng.
Ngoài ra so với nghiên cứu về virus cúm A/H5 của Connie và cộng sự (Connie Leung et al., 2013), nghiên cứu này có sự khác nhau về con đường bài thải virus cụ thể trong nghiên cứu của Connie viruscúm A/H5 bài thải qua cả 2 đường hầu họng và ổ nhớp nhưng trong nghiên cứu H9N2 của chúng tôi virus bài thải qua đường hầu họng. Bên cạnh đó so với kết quả một số nghiên cứu đánh giá độc lực của cúm A/H5N1 được thực hiện tại Trung tâm Chẩn đoán trước đó (Cục Thú y, 2014, 2015) nghiên cứu này cũng có sự khác biệt về thời gian bài thải virus và đường bài thải virus. Trong các thí nghiệm về virus cúm A/H5N1 trước đây, sự bài thải virus cúm H5N1 được xác định xảy ra trên cả 2 đường hầu họng và ổ nhớp đồng thời thời gian bài thải virus kéo dài đến ngày cuối cùng sau gây nhiễm (ngày 10) của thí nghiệm.Tuy nhiên trong thí nghiệm của chúng tôi thời gian bài thải virus cúm H9N2 chỉ đến hết ngày thứ 6 sau gây nhiễm và virus chỉ bài thải qua đường hầu họng.
Việc phát hiện virus cúm A/H9 chỉ có trên mẫu swab hầu họngmà không có