Phần 3 Nội dun g nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu
3.3. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3.2.7. Phát hiện virus bằng phản ứng Realtime RT-PCR
a. Chiết tách ARN của virus gia cầm A/H9N2 bằng kít Qiagen RNeasy minikit.
Trình tự các bước Chuẩn bị
Chuẩn bị dung môi RLT (600µl/mẫu) vào ống ly tâm 50ml. Thêm 1/100 β- Mercaptoethanol (β-ME) vào dung môi RLT.
Dung môi này có thể bảo quản 1 tháng ở nhiệt độ phòng. Tiến hành tách chiết
- Lắc vortex mẫu trong 15 giây và ly tâm nhanh (spin down).
- Cho 600 µl dung môi RLT đã bổ sung β- ME vào ống eppendorf 1,5 ml. - Chuyển 200 µl mẫu sang ống 1,5 ml.
- Lắc vortex trong 15 giây và ly tâm nhanh .
- Cho 400 µl cồn tuyệt đối 100%, và lắc vortex trong 15 giây. - Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. - Đặt ống cột lọc (spin column) vào hệ thống hút chân không. - Chuyển tất cả dung dịch mẫu sang cột lọc và bật máy hút. Rửa lần 1
- Cho 700 µl dung môi RW1 vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi hút hết lượng mẫu trong cột lọc.
Rửa lần 2
- Cho 500µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi hút hết lượng mẫu trong cột lọc.
- Cho tiếp 500 µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi hút hết lượng mẫu trong cột lọc.
- Đặt cột lọc vào ống thu mới (collection tube).
- Ly tâm cột lọc với tốc độ 12000 vòng phút trong 2 phút. Thu ARN
- Chuyển cột lọc sang ống 1.5ml eppendorf mới.
- Cho 50-100µl nước (ARNse-free H2O) vào cột lọc, đợt 1 phút. - Ly tâm 1 phút ở tốc độ >10.000 phòng/ phút.
- Chuyển mẫu ARN đã thu sang ống 1.5ml mới. Cất giữ ARN
Có thể giữARN ở 40C trong vài giờ nếu xét nghiệm ngay. Cất giữ ở nhiệt độ -200C nếu chưa dùng ngay trong ngày để bảo quản ARN.
b. Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR (RRT-PCR)sử dụng primer và probe thiết kế đặc hiệu cho virus cúm gia cầm A/H9N2.
Bảng 3.3. Trình tự primer và probe phát hiện virus cúm gia cầm A/H9N2
Gen Primer/Probe Chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu
5’ 3’
M
Mồi xuôi 1 GACCRATCCTGTCACCTCTGAC Mồi ngược 1 AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA Probe 1 TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1 Mồi xuôi 2 AGATGAGYCTTCTAACCGAGGTCG Mồi ngược 2 TGCAAANACATCYTCAAGTCTCTG Probe 2 TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA FAM BHQ1
H9HA
Mồi xuôi ATGGGGTTTGCTGCC
Mồi ngược TTATATACAAATGTTGCAYCTG
Probe TTCTGGGCCATGTCCAATGG FAM BHQ1
N2NA
Mồi xuôi AAGCATGGCTGCATGTTTGTG Mồi ngược ACCAGGATATCGAGGATAACAGGA
Probe TGCTGAGCACTTCCTGACAATGGGCT FAM BHQ1 Nguồn: CSIRO-AAHL, Australia
Bảng 3.4. Hỗn hợp nguyên liệu (Master mix) cho phản ứng RRT-PCR
Invitrogen superscriptIII qRT-PCR kit
Tên nguyên liệu Lượng (μl)
Nước ARNse/Dnase free 5,5 2x Reaction buffer 12,5 Forward primer (20 μM ) 0,5 Reverse primer (20 μM) 0,5
Probe (6 μM) 0,5
Enzyme mix 0,5
- Cho 20 µl master mix vào ống PCR. - Cho 5 µl mẫu ARN vào ống PCR.
- Đặt ống PCR vào máy real-time PCR machine. - Chạy chương trình.
- Chọn đọc màu bước kéo dài (annealing). Chu trình nhiệt của phản ứng:
- 500C - 15 phút; - 950C - 2 phút;
- 40 chu kỳ (950C -10 giây + 580C -50 giây).
Đọc kết quả: Kết quả xét nghiệm được công nhận khi:
- Đối chứng dương tính cho giá trị Ct (Cycle threshold – ngưỡng vòng) đã biết (±2);
- Đối chứng âm tính không có Ct;
- Mẫu được coi là dương tính khi có Ct <=35; - Mẫu được coi là âm tính nếu không có Ct; - Mẫu được coi là nghi ngờ nếu Ct >35. 3.3.2.8. Phương pháp xử lý số liệu
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KHẢO SÁT SỰ LƯU HÀNH VIRUS CÚM A/H9 TẠI MỘT SỐ TỈNH VIỆT NAM VIỆT NAM
Trong những năm gần đây, tình hình dịch bệnh cúm A/H5 xảy ra ở nhiều tỉnh thành của Việt Nam gây nên thiệt hại kinh tế rất lớn. Cùng với sự xuất hiện của virus cúm gia cầm chủng độc lực cao A/H5, từ năm 2009 đến nay tại Việt Nam đã có những ghi nhận sự xuất hiện virus cúm H9N2 trên đàn gia cầm (Hotta et al., 2012; Nomura et al., 2012). Trong phạm vi nghiên cứu, để đánh giá tình trạng lưu hành virus cúm A/H9 tại một số tỉnh Việt Nam chúng tôi sử dụng các mẫu bệnh phẩm swab của chương trình giám sát H7N9 của FAO trên gà sống bán tại chợ thuộc 6 tỉnh Việt Nam là Cao Bằng, Lào Cai, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hà Giang và các mẫu bệnh phẩm gà nghi cúm thu được từ các địa phương trên trong 3 tháng cuối năm 2014 và 6 tháng đầu năm 2015. Các mẫu xét nghiệm dương tính cúm gia cầm type A sau đó được xác định tiếp với gen cúm H9 bằng phương pháp Realtime RT-PCR. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả xác định virus cúm A/H9 tại một số tỉnh Việt Nam
Stt Tỉnh Loại mẫu Tổng số mẫu XN Số mẫu (+) cúm A Tỷ lệ (+) cúm A (%) Số mẫu (+) H9 Tỷ lệ (+) cúm H9 (%) 1 Cao Bằng Swab 350 149 42,57 92 26,29 2 Lào Cai Swab 350 195 55,71 94 26,86
Phủ tạng 7 5 71,43 0 0,00 3 Bắc Ninh Swab 350 142 40,57 80 22,86 Phủ tạng 1 1 100,00 0 0,00 4 Bắc Giang Swab 350 173 49,43 62 17,71 5 Hà Nội Swab 350 58 16,57 34 9,71 Phủ tạng 8 2 25,00 1 12,50 6 Hà Giang Swab 350 123 35,14 60 17,14 Tổng 2116 848 40,08 423 19,99
Hình 4.1. Tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H9 tại một số tỉnh Việt Nam Kết quả số liệu thu được tại bảng 4.1 và hình 4.1 về tỷ lệ lưu hành virus Kết quả số liệu thu được tại bảng 4.1 và hình 4.1 về tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H9 cho thấy, trong tổng số 2116 mẫu bệnh phẩm thu thập làm xét nghiệm từ 6 tỉnh Việt Nam là Cao Bằng, Lào Cai, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội và Hà Giang có 848 mẫu dương tính cúm A chiếm tỷ lệ 40,08%. Các mẫu dương tính với virus cúm A được tiếp tục xét nghiệm bằng phương pháp Realtime RT-PCR với cặp mồi gen H9 để phát hiện virus cúm A/H9 cho kết quả là 423 mẫu dương tính virus cúm H9 trên tổng số 2116 mẫu xét nghiệm chiếm tỷ lệ 19,99%. Trong đó Cao Bằng và Lào Cai là 2 tỉnh có số mẫu dương tính virus cúm H9 cao nhất 92/350 mẫu xét nghiệm chiếm tỷ lệ 26,29% và 94/357 mẫu xét nghiệm chiếm tỷ lệ 26,33%. Tỉnh có tỷ lệ dương tính cúm H9 thấp nhất trong 6 tỉnh là tỉnh Hà Nội 9,78%tương đương số mẫu dương tính cúm H9 là 35/358 mẫu xét nghiệm.
Với tỷ lệ phát hiện virus cúm gia cầm H9 trung bình là 19,99% có thể thấy tình trạng lưu hành virus cúm gia cầm H9 trên đàn gà sống tại các chợ thuộc 6 tỉnh Việt Nam là tương đối cao. Đây có thể là một mối nguy cơ mới đối với ngành chăn nuôi và thú y Việt Nam bởi vì virus cúm gia cầm H9 chủ yếu phát hiện được trên đàn gà sống đang được buôn bán tại chợ, điều này dễ dẫn đến tình trạng lây lan virus cúm H9 sang các tỉnh khác. Bên cạnh đó song hành có sự tồn tại các chủng virus cúm khác điều này rất có thể dễ dẫn đến nguy cơ tiềm ẩn việc tái tổ hợp hình thành chủng virus mới giống như trong nghiên cứu của các nhà khoa học Paskistan gây ra những nguy hiểm mà chúng ta không lường trước được cho sức khỏe đàn gia cầm cũng như của cộng đồng.
4.2. PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH VIRUS CÚM A/H9N2 TẠI MỘT SỐ TỈNH VIỆT NAM TỈNH VIỆT NAM
Đối với 423 mẫu bệnh phẩm swab và phủ tạng dương tính cúm H9 ở trên chúng tôi tiếp tục tiến hành phân lập bằng cách tiêm truyền trên trứng gà có phôi 9 ngày tuổi sau đó giám định lại các mẫu phân lập dương tính bằng phương pháp realtime RT-PCR. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả phân lập và giám định virus H9N2tại một số tỉnh Việt Nam
Stt Tỉnh Số mẫu phân lập Kết quả Số mẫu (+) HA Dương tính Newcastle (RRT-PCR) Dương tính H5N1 (RRT-PCR) Dương tính H9N2 (RRT-PCR) 1 Cao Bằng 92 7 0 0 7 2 Lào Cai 94 2 0 0 2 3 Bắc Ninh 80 5 0 0 5 4 Bắc Giang 62 0 0 0 0 5 Hà Nội 35 3 0 0 3 6 Hà Giang 60 3 0 0 3 Tổng 423 20 0 0 20
Kết quả bảng 4.2 cho thấy, trong tổng số 423 mẫu bệnh phẩm gây nhiễm lên phôi trứng gà có 20 mẫu phân lập và giám định dương tính với virus H9N2. Các mẫu bệnh phẩm còn lại không phân lập được nguyên nhân có thể do virus đã chết trong thời gian bảo quản và vận chuyển mẫu.
Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA Phản ứng realtime RT-PCR với gen H9
Hình 4.2. Hình ảnh một số phản ứng trong phân lập và giám định virus cúm A/H9N2 cúm A/H9N2
Từ 20 mẫu bệnh phẩm phân lập dương tính cúm H9N2, chúng tôi chọn ra 5 mẫu đại diện cho 5 khu vực, đặt tên cho từng chủng virus để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo, chi tiết được thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả định tính và định tên chủng virus cúm gia cầm H9N2 tại 5 tỉnh Việt Nam tỉnh Việt Nam
Stt Tỉnh Tên mẫu Loại
mẫu Kết quả định type virus Tên chủng virus 1 Cao Bằng H7F/14-CB4-2 Swab H9N2 2 H7F/14-CB4-18 Swab H9N2 A/ck/VN/H7F-14-CB4- 18/2014(H9N2) 3 H7F/14-CB4-19 Swab H9N2 4 H7F/14-CB4-29 Swab H9N2 5 H7F/14-CB4-31 Swab H9N2 6 H7F/14-CB4-33 Swab H9N2 7 H7F/14-CB4-34 Swab H9N2 8 Lào Cai H7F/14-LC4-183 Swab H9N2 A/ck/VN/H7F-14-LC4- 183/2014(H9N2) 9 H7F/14-LC4-211 Swab H9N2 10 Bắc Ninh H7F/14-BN4-315 Swab H9N2 11 H7F/14-BN4-339 Swab H9N2 A/ck/VN/H7F-14-BN4- 339/2014(H9N2) 12 H7F/14-BN4-342 Swab H9N2 13 H7F/14-BN4-423 Swab H9N2 14 H7F/14-BN4-437 Swab H9N2 15 Hà Nội H7F/14-HN4-467 Swab H9N2 16 H7F/14-HN4-564 Swab H9N2 17 15A53 Phủ tạng H9N2 A/ck/VN/NCVD- 15A53/2015(H9N2) 18 Hà Giang H7F/14-HG4-393 Swab H9N2 19 H7F/14-HG4-413 Swab H9N2 A/ck/VN/H7F-14-HG4- 413/2014(H9N2) 20 H7F/14-HG4-480 Swab H9N2
4.3. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM GIA CẦM A/H9N2 PHÂN LẬP TRÊN GÀ TẠI VIỆT NAM CẦM A/H9N2 PHÂN LẬP TRÊN GÀ TẠI VIỆT NAM
4.3.1. Đặc tính sinh trưởng phát triển của virus trên phôi trứng gà
Virus cúm nói chung và virus cúm gia cầm A/H9N2 nói riêng có khả năng phát triển tốt trên phôi trứng gia cầm. Tuy nhiên, các chủng virus cúm gia cầm có đặc điểm khác nhau khi nhân lên trên phôi trứng, thể hiện bằng sự gây nhiễm phôi, gây chết phôi và hiệu giá của virus khi nhân lên trên phôi trứng. Vì vậy để xác định đặc tính sinh trưởngcủa virus cúm A/H9N2 chúng tôi tiến hành gây nhiễm virus lên phôi trứng gà 9 ngày tuổi và đánh giá sự phát triển của virus theo thời gian bằng hiệu giá ngưng kết hồng cầu HA của virus.
Trứng gà được mua về lúc phôi 8 ngày tuổi và ấp tiếp 1 ngày để ổn định tại phòng thí nghiệm trước khi sử dụng. 5 chủng virus cúm gia cầm A/H9N2 được xử lý lọc vô trùng qua màng lọc có đường kính 0,45µm và được pha loãng thành 1/10 với dung dịch đệm PBS có pH 7,2. Mỗi chủng sử dụng 5 trứng gà có phôi và gây nhiễm vào xoang niệu mô với liều 200µl/phôi, ấp tiếp ở nhiệt độ 370C, kiểm tra trứng 2 lần/ngày và cách nhau khoảng 8 giờ trong vòng 5 ngày, loại phôi chết trước 24 giờ. Trong thí nghiệm này có sử dụng 5 phôi trứng tiêm dung dịch PBS làm đối chứng âm và ấp trong cùng điều kiện.
Nếu có phôi trứng chết trong thời gian theo dõi được làm lạnh ở nhiệt độ 2- 80C trong vòng 24 giờ cho mạch máu co lại và tiến hành mổ trứng thu hoạch dịch niệu mô, kiểm tra hiệu giá HA. Những phôi trứng sống sau khi gây nhiễm cứ sau 24 giờ một lượng dịch niệu mô được thu kiểm tra đánh giá sự phát triển của virus bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu HA.
Kết quả nhận được sau 5 ngày theo dõi là không có phôi trứng chết.
Virus phát triển qua từng thời điểm được đánh giá bằng hiệu giá HA thu được. Kết quả được trình bày ở bảng 4.4 và hình 4.3.
Qua số liệu ở bảng 4.4 và hình 4.3 thể hiện khả năng sinh trưởng của virus cúm A/H9N2 theo thời gian cho thấy: Trong 1-2 ngày sau khi gây nhiễm lên phôi trứng gà, 5 chủng virus cúm A/H9N2 đều có hiệu giá HA tăng cao. Cụ thể ở thời điểm mới gây nhiễm, hiệu giá HA trung bình của 5 chủng virus là 2-4 log2 đã tăng lên là 6-7 log2 trong 1 ngày sau nhiễm và đạt 9-10 log2 trong 2 ngày sau gây nhiễm. Từ đó cho đến ngày thứ 5 sau khi nhiễm, virus phát triển ở pha cân bằng, hiệu giá HA của virus không tăng lên và vẫn giữ nguyên trung bình từ 9-10 log2.
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra hiệu giá HA của virus cúm A/H9N2
Chủng virus
Hiệu giá ngưng kết hồng cầu gà HA (log2)
Ngày 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 A/ck/VN/H7F-14-CB4- 18/2014(H9N2) 3 7 10 10 10 10 A/ck/VN/H7F-14-LC4- 183/2014(H9N2) 3 6 10 10 10 10 A/ck/VN/H7F-14-BN4- 339/2014(H9N2) 3 7 10 10 10 10 A/ck/VN/NCVD- 15A53/2015(H9N2) 2 7 9 9 9 9 A/ck/VN/H7F-14-HG4- 413/2014(H9N2) 4 7 10 10 10 10
Hình 4.3. Khả năng sinh trưởng của virus cúm A/H9N2 theo thời gian Như vậy cả 5 chủng virus cúm A/H9N2 đều sinh trưởng tốt trên môi trường Như vậy cả 5 chủng virus cúm A/H9N2 đều sinh trưởng tốt trên môi trường phôi trứng gà.
Phôi trứng gà đối chứng Phôi trứng gà sau 5 ngày gây nhiễm virus cúm A/H9N2 (không chết,
không bệnh tích) Hình 4.4. Hình ảnh phôi trứng gà sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 4.3.2. Đặc tính sinh trưởng phát triển của virus trên tế bào xơ phôi gà (CEF)
Bên cạnh việc xác định tính sinh trưởng phát triển của virus cúm A/H9N2 trên phôi trứng gà 9 ngày tuổi, chúng tôi cũng tiến hành gây nhiễm chủng virus này trên tế bào xơ phôi gà (CEF) và đánh giá khả năng sinh trưởng của virus theo thời gian bằng phản ứng HA.
Chúng tôi sử dụng phôi trứng gà SPF 8 ngày tuổi, mổ trứng và thu hoạch phôi để chế môi trường tế bào CEF. Tế bào CEF được chuẩn bị trên chai T25 đã phát triển thành lớp sau khi nuôi dưỡng bằng môi trường MEM với 5% huyết thanh thai bê (FBS). Đối với mỗi mẫu virus chúng tôi chuẩn bị 5 chai tế bào chứa môi trường MEM như nhau. Virus cúm A/H9N2 được pha loãng tỷ lệ 1/10 bằng môi trường MEM rồi gây nhiễm 200µl hỗn dịch này vào 4 chai và 200µl môi trường MEM vào chai đối chứng âm.
Các chai tế bào gây nhiễm được nuôi tiếp trong tủ ấm 370C có 5% CO2 trong vòng 5 ngày và theo dõi hàng ngày để quan sát bệnh tích tế bào (CPE) nếu có. Cứ sau 24 giờ một lượng dịch tế bào được thu kiểm tra đánh giá sự phát triển của virus bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu HA.
Kết quả sau 5 ngày theo dõi, các chai tế bào nhiễm virus đều không thấy xuất hiện bệnh tích tế bào (CPE).
Virus thu được qua các thời điểm được đánh giá sự sinh trưởng thông qua hiệu giá HA thu được. Kết quả được trình bày ở bảng 4.5 và hình 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra hiệu giá HA của virus cúm A/H9N2
Chủng virus
Hiệu giá ngưng kết hồng cầu HA (log2)
Ngày 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 A/ck/VN/H7F-14-CB4- 18/2014(H9N2) 2 2 2 2 2 2 A/ck/VN/H7F-14-LC4- 183/2014(H9N2) 2 2 2 2 2 2 A/ck/VN/H7F-14-BN4- 339/2014(H9N2) 2 2 2 2 2 2 A/ck/VN/NCVD- 15A53/2015(H9N2) 2 2 2 2 2 2 A/ck/VN/H7F-14-HG4- 413/2014(H9N2) 3 3 3 3 3 3
Qua kết quả ở bảng 4.5 và hình 4.5 về khả năng sinh trưởng của virus cúm trên môi trường tế bào xơ phôi CEF cho thấy: sau 5 ngày gây nhiễm, hiệu giá HA