Phần 3 Nội dun g nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu
3.3. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3.2.3. Phương pháp phân lập trên phôi trứng gà
- Phương pháp phân lập như sau (TCVN, 2010): Bệnh phẩm là dịch swab (ngoáy ổ nhớp của gà) của gà được xử lý bằng cách lắc ống dịch swab có tăm bông bên trong, rồi ly tâm sau đó chuyển dịch nổi sang ống 1,5 ml và vô trùng bằng kháng sinh hoặc lọc vô trùng qua màng lọc vô trùng 0,45µm.
- Bệnh phẩm là phủ tạng: Nghiền bệnh phẩm bằng cối chày sứ vô trùng thành huyễn dịch 10 % với dung dịch vận chuyển hoặc bằng PBS 0,01M pH = 7,2. Chuyển sang ống ly tâm, ly tâm với tốc độ 2.000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch nổi. Vô trùng bằng lọc qua màng lọc vô trùng 0,45µm.
- Sử dụng phôi trứng gà sạch 9-11 ngày tuổi.
- Tiêm 0,2 ml dịch bệnh phẩm (dịch swab hoặc dịch nghiền phủ tạng) vào xoang niệu mô của phôi trứng gà, tiếp tục ấp ở nhiệt độ 370C đến 96 giờ, soi trứng hàng ngày, thu trứng chết và cả trứng không chết đến ngày theo dõi cuối cùng và kiểm tra bằng phản ứng HA để xác định khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà và phản ứng HI với kháng thể chuẩn kháng virus cúm gia cầm và kháng thể chuẩn kháng virus Newcastle để giám định virus phân lập được.
- Phôi trứng được giữ ở tủ mát 2 – 80C ít nhất 2 giờ trước khi thu hoạch dịch niệu mô. Dùng syringe 5 ml hoặc 10 ml thu dịch niệu mô bằng cách đâm
xuyên qua nắp buồng hơi. Dịch niệu mô được chia thành nhiều ống nhỏ (0,5 ml/ống) giữ ở nhiệt độ -700C.
- Bố trí thí nghiệm xác định đặc tính phát triển của virus trên môi trường phôi trứng gà:
+ Lô thí nghiệm: liều tiêm: 200 µl huyễn dịch bệnh phẩm/phôi trứng. Số lượng phôi trứng: 3- 5 phôi trứng/ mẫu.
+ Lô đối chứng: liều tiêm 200 µl PBS/phôi trứng.
Số lượng phôi trứng: 3 - 5 phôi trứng/ mẫu.
Theo dõi quan sát hàng ngày, loại bỏ trứng chết, cất trứng chết ở 40C, mổ trứng kiểm tra hiệu giá HA. Cứ 24 giờ, một lượng dịch niệu mô được thu, kiểm tra hiệu giá HA để đánh giá khả năng phát triển của virus.
3.3.2.4. Xác định chỉ số EID50, TCID50
a. Chỉ số EID50(FAO, 2002)
- Để tính EID50, virus được pha loãng thành nhiều nồng độ theo cơ số 10 (ví dụ 10-1, 10-2….10-9) và tiêm vào xoang niệu mô của phôi trứng (0,1ml/phôi/5 phôi), ấp ở tủ ấp 370C tới 96 giờ.
- Soi trứng hàng ngày để kiểm tra phôi sống và phôi chết, thu các trứng chết và trứng sống, thu hoạch nước trứng. Thực hiện phản ứng HA đối với nước trứng. Mẫu nào có phản ứng HA dương tính, được coi là nhiễm virus A/H9N2. Sử dụng công thức Reed- Muench để xác định chỉ số EID50 của virus.
b. Chỉ số TCID50(FAO, 2002)
- Sử dụng môi trường tế bào xơ phôi gà chế từ phôi trứng gà 8 ngày tuổi (hoặc tế bào dòng MDCK) để chuẩn độ virus cúm gia cầm. Tế bào được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng (lượng tế bào là 5 x104 tế bào/100 µl/giếng). Virus được pha loãng theo các nồng độ 10-2….10-9 với môi trường Eagle’s MEM , mỗi nồng độ 5 giếng, mỗi giếng 100 µl dung dịch virus đã pha loãng ở các nồng độ đã xác định. Quan sát CPE và kiểm tra HA sau 2 ngày. Sử dụng công thức Reed- Muench để tính chỉ số TCID50 của virus. Cách tính TCID50 cũng giống với cách tính EID50.
c. Phương pháp Reed-Muench
Sử dụng bảng tổng hợp số liệu (Bảng 3.1) để tính toán chỉ số EID50 hoặc TCID50.
Giá trị EID50 và TCID50 được tính ở hiệu giá pha loãng cận trên 50% cộng với chỉ số tính được ở trên. Ví dụ nếu tính được chỉ số là 0,5 với độ pha loãng virus cao nhất có tỷ lệ nhiễm 50% là 107, thì chuẩn độ của virus sẽ là 107,5.
Bảng 3.1. Bảng tổng hợp số liệu tính toán theo phương pháp Reed-Muench
-Bố trí thí nghiệm xác định đặc tính sinh trưởng trên môi trường tế bào: + Lô thí nghiệm: liều nhiễm: 200 µl huyễn dịch bệnh phẩm/chai T25 chứa 5 ml dung dịch MEM.
Số lượng tế bào: 3 - 5 chai/mẫu.
+ Lô đối chứng: liều nhiễm 200 µl PBS/ chai T25 chứa 5 ml dung dịch MEM. Số lượng tế bào: 1 chai/mẫu.
Theo dõi quan sát hàng ngày, loại bỏ trứng chết, cất trứng chết ở 40C, mổ trứng kiểm tra hiệu giá HA. Cứ 24h, một lượng dịch tế bào được thu kiểm tra hiệu giá HA để đánh giá khả năng phát triển của virus.
3.3.2.5. Phương pháp xác định chỉ số độc lực của virus (IVPI) Xác định chỉ số IVPI (OIE, 2015) thực hiện như sau Xác định chỉ số IVPI (OIE, 2015) thực hiện như sau
- Kiểm tra kháng thể cúm gia cầm trước khi gây bệnh (công cường độc) bằng phương pháp Elisa, chỉ sử dụng gia cầm không có kháng thể kháng virus cúm gia cầm.
- Kiểm tra gà không nhiễm một số bệnh khác như Gumboro, viêm phế quản truyền nhiễm, Newcastle.
- Bố trí thí nghiệm như sau:
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm xác định chỉ số độc lực của virus (IVPI)
Nhóm gà Số con Liều tiêm Ghi chú
Thí nghiệm 10 106 EID50 (100 µl/con) Tiêm qua đường tĩnh mạch và nuôi cách ly 2 nhóm gà thí nghiệm Đối chứng 3 100 µl PBS/con
- Theo dõi trong vòng 10 ngày để đánh giá độc lực của virus bằng chỉ số điểm lâm sàng trung bình. (Theo phương pháp của OIE, virus được đánh giá là có độc lực cao-HPAI nếu điểm lâm sàng trung bình lớn hơn 1,2).
- Lấy mẫu dịch ngoáy hầu họng và ổ nhớp của tất cả các gà sống và chết vào các ngày 3, 7 và 10 sau khi gây nhiễm virus, xét nghiệm cúm A/H9N2 bằng phương pháp RRT-PCR để xác định mức độ bài thải virus của gà.
- Các gà chết được mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm não, phổi – khí quản, tim, gan, lách, thận, ruột - tụy và lông xét nghiệm cúm A/H9N2 bằng phương pháp RRT-PCR để đánh giá khả năng đa nhiễm các cơ quan của virus.
- Cho điểm lâm sàng gia cầm thí nghiệm như sau:
Chỉ tiêu đánh giá Điểm số
Bình thường 0 điểm
Ốm nhẹ (có biểu hiện 1 trong các triệu chứng bệnh) 1 điểm Ốm nặng (có biểu hiện từ 2 triệu chứng bệnh trở lên) 2 điểm
Chết 3 điểm
Triệu chứng bệnh sau khi nhiễm virus cúm: các dấu hiệu về hô hấp, ủ rũ, ỉa chảy, tím tái dưới da, phù mặt hoặc phù đầu, các dấu hiệu về thần kinh.
Sau đó cộng điểm từng ngày của mỗi gia cầm thí nghiệm và tính trung bình trên số ngày thí nghiệm. Có thể tính tiếp trung bình cho cả lô thí nghiệm.
Ví dụ:
Ngày sau tiến hành thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 TB
Điểm gia cầm TN 0 0 1 2 3 3 1,5
3.3.2.6. Phương pháp HA (OIE 2012)
- Phương pháp HA: tiến hành phản ứng trên đĩa microtiter 96 giếng đáy V (tổng lượng hỗn dịch phản ứng là 75µl/giếng).
+ Cho 25 µl dung dịch PBS pH 7,2 vào các giếng của đĩa phản ứng;
+ Cho 25 µl dung dịch chứa virus (nước trứng) vào giếng thứ nhất và bắt đầu pha loãng kháng nguyên virus theo cơ số 2 từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11;
+ Nhỏ 25 µl dung dịch PBS vào các giếng từ 1đến giếng thứ 12;
+ Nhỏ 25 µl dung dịch hồng cầu gà 1% (lấy từ gà trống khỏe mạnh) vào các giếng từ giếng 1-12. Để 15-30 phút ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả ngưng kết;
+ Hiệu giá ngưng kết hồng cầu gà (HA) là nồng độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ngưng kết toàn phần.
3.3.2.7. Phát hiện virus bằng phản ứng Realtime RT-PCR
a. Chiết tách ARN của virus gia cầm A/H9N2 bằng kít Qiagen RNeasy minikit.
Trình tự các bước Chuẩn bị
Chuẩn bị dung môi RLT (600µl/mẫu) vào ống ly tâm 50ml. Thêm 1/100 β- Mercaptoethanol (β-ME) vào dung môi RLT.
Dung môi này có thể bảo quản 1 tháng ở nhiệt độ phòng. Tiến hành tách chiết
- Lắc vortex mẫu trong 15 giây và ly tâm nhanh (spin down).
- Cho 600 µl dung môi RLT đã bổ sung β- ME vào ống eppendorf 1,5 ml. - Chuyển 200 µl mẫu sang ống 1,5 ml.
- Lắc vortex trong 15 giây và ly tâm nhanh .
- Cho 400 µl cồn tuyệt đối 100%, và lắc vortex trong 15 giây. - Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. - Đặt ống cột lọc (spin column) vào hệ thống hút chân không. - Chuyển tất cả dung dịch mẫu sang cột lọc và bật máy hút. Rửa lần 1
- Cho 700 µl dung môi RW1 vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi hút hết lượng mẫu trong cột lọc.
Rửa lần 2
- Cho 500µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi hút hết lượng mẫu trong cột lọc.
- Cho tiếp 500 µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi hút hết lượng mẫu trong cột lọc.
- Đặt cột lọc vào ống thu mới (collection tube).
- Ly tâm cột lọc với tốc độ 12000 vòng phút trong 2 phút. Thu ARN
- Chuyển cột lọc sang ống 1.5ml eppendorf mới.
- Cho 50-100µl nước (ARNse-free H2O) vào cột lọc, đợt 1 phút. - Ly tâm 1 phút ở tốc độ >10.000 phòng/ phút.
- Chuyển mẫu ARN đã thu sang ống 1.5ml mới. Cất giữ ARN
Có thể giữARN ở 40C trong vài giờ nếu xét nghiệm ngay. Cất giữ ở nhiệt độ -200C nếu chưa dùng ngay trong ngày để bảo quản ARN.
b. Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR (RRT-PCR)sử dụng primer và probe thiết kế đặc hiệu cho virus cúm gia cầm A/H9N2.
Bảng 3.3. Trình tự primer và probe phát hiện virus cúm gia cầm A/H9N2
Gen Primer/Probe Chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu
5’ 3’
M
Mồi xuôi 1 GACCRATCCTGTCACCTCTGAC Mồi ngược 1 AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA Probe 1 TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1 Mồi xuôi 2 AGATGAGYCTTCTAACCGAGGTCG Mồi ngược 2 TGCAAANACATCYTCAAGTCTCTG Probe 2 TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA FAM BHQ1
H9HA
Mồi xuôi ATGGGGTTTGCTGCC
Mồi ngược TTATATACAAATGTTGCAYCTG
Probe TTCTGGGCCATGTCCAATGG FAM BHQ1
N2NA
Mồi xuôi AAGCATGGCTGCATGTTTGTG Mồi ngược ACCAGGATATCGAGGATAACAGGA
Probe TGCTGAGCACTTCCTGACAATGGGCT FAM BHQ1 Nguồn: CSIRO-AAHL, Australia
Bảng 3.4. Hỗn hợp nguyên liệu (Master mix) cho phản ứng RRT-PCR
Invitrogen superscriptIII qRT-PCR kit
Tên nguyên liệu Lượng (μl)
Nước ARNse/Dnase free 5,5 2x Reaction buffer 12,5 Forward primer (20 μM ) 0,5 Reverse primer (20 μM) 0,5
Probe (6 μM) 0,5
Enzyme mix 0,5
- Cho 20 µl master mix vào ống PCR. - Cho 5 µl mẫu ARN vào ống PCR.
- Đặt ống PCR vào máy real-time PCR machine. - Chạy chương trình.
- Chọn đọc màu bước kéo dài (annealing). Chu trình nhiệt của phản ứng:
- 500C - 15 phút; - 950C - 2 phút;
- 40 chu kỳ (950C -10 giây + 580C -50 giây).
Đọc kết quả: Kết quả xét nghiệm được công nhận khi:
- Đối chứng dương tính cho giá trị Ct (Cycle threshold – ngưỡng vòng) đã biết (±2);
- Đối chứng âm tính không có Ct;
- Mẫu được coi là dương tính khi có Ct <=35; - Mẫu được coi là âm tính nếu không có Ct; - Mẫu được coi là nghi ngờ nếu Ct >35. 3.3.2.8. Phương pháp xử lý số liệu
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KHẢO SÁT SỰ LƯU HÀNH VIRUS CÚM A/H9 TẠI MỘT SỐ TỈNH VIỆT NAM VIỆT NAM
Trong những năm gần đây, tình hình dịch bệnh cúm A/H5 xảy ra ở nhiều tỉnh thành của Việt Nam gây nên thiệt hại kinh tế rất lớn. Cùng với sự xuất hiện của virus cúm gia cầm chủng độc lực cao A/H5, từ năm 2009 đến nay tại Việt Nam đã có những ghi nhận sự xuất hiện virus cúm H9N2 trên đàn gia cầm (Hotta et al., 2012; Nomura et al., 2012). Trong phạm vi nghiên cứu, để đánh giá tình trạng lưu hành virus cúm A/H9 tại một số tỉnh Việt Nam chúng tôi sử dụng các mẫu bệnh phẩm swab của chương trình giám sát H7N9 của FAO trên gà sống bán tại chợ thuộc 6 tỉnh Việt Nam là Cao Bằng, Lào Cai, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hà Giang và các mẫu bệnh phẩm gà nghi cúm thu được từ các địa phương trên trong 3 tháng cuối năm 2014 và 6 tháng đầu năm 2015. Các mẫu xét nghiệm dương tính cúm gia cầm type A sau đó được xác định tiếp với gen cúm H9 bằng phương pháp Realtime RT-PCR. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả xác định virus cúm A/H9 tại một số tỉnh Việt Nam
Stt Tỉnh Loại mẫu Tổng số mẫu XN Số mẫu (+) cúm A Tỷ lệ (+) cúm A (%) Số mẫu (+) H9 Tỷ lệ (+) cúm H9 (%) 1 Cao Bằng Swab 350 149 42,57 92 26,29 2 Lào Cai Swab 350 195 55,71 94 26,86
Phủ tạng 7 5 71,43 0 0,00 3 Bắc Ninh Swab 350 142 40,57 80 22,86 Phủ tạng 1 1 100,00 0 0,00 4 Bắc Giang Swab 350 173 49,43 62 17,71 5 Hà Nội Swab 350 58 16,57 34 9,71 Phủ tạng 8 2 25,00 1 12,50 6 Hà Giang Swab 350 123 35,14 60 17,14 Tổng 2116 848 40,08 423 19,99
Hình 4.1. Tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H9 tại một số tỉnh Việt Nam Kết quả số liệu thu được tại bảng 4.1 và hình 4.1 về tỷ lệ lưu hành virus Kết quả số liệu thu được tại bảng 4.1 và hình 4.1 về tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H9 cho thấy, trong tổng số 2116 mẫu bệnh phẩm thu thập làm xét nghiệm từ 6 tỉnh Việt Nam là Cao Bằng, Lào Cai, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội và Hà Giang có 848 mẫu dương tính cúm A chiếm tỷ lệ 40,08%. Các mẫu dương tính với virus cúm A được tiếp tục xét nghiệm bằng phương pháp Realtime RT-PCR với cặp mồi gen H9 để phát hiện virus cúm A/H9 cho kết quả là 423 mẫu dương tính virus cúm H9 trên tổng số 2116 mẫu xét nghiệm chiếm tỷ lệ 19,99%. Trong đó Cao Bằng và Lào Cai là 2 tỉnh có số mẫu dương tính virus cúm H9 cao nhất 92/350 mẫu xét nghiệm chiếm tỷ lệ 26,29% và 94/357 mẫu xét nghiệm chiếm tỷ lệ 26,33%. Tỉnh có tỷ lệ dương tính cúm H9 thấp nhất trong 6 tỉnh là tỉnh Hà Nội 9,78%tương đương số mẫu dương tính cúm H9 là 35/358 mẫu xét nghiệm.
Với tỷ lệ phát hiện virus cúm gia cầm H9 trung bình là 19,99% có thể thấy tình trạng lưu hành virus cúm gia cầm H9 trên đàn gà sống tại các chợ thuộc 6 tỉnh Việt Nam là tương đối cao. Đây có thể là một mối nguy cơ mới đối với ngành chăn nuôi và thú y Việt Nam bởi vì virus cúm gia cầm H9 chủ yếu phát hiện được trên đàn gà sống đang được buôn bán tại chợ, điều này dễ dẫn đến tình trạng lây lan virus cúm H9 sang các tỉnh khác. Bên cạnh đó song hành có sự tồn tại các chủng virus cúm khác điều này rất có thể dễ dẫn đến nguy cơ tiềm ẩn việc tái tổ hợp hình thành chủng virus mới giống như trong nghiên cứu của các nhà khoa học Paskistan gây ra những nguy hiểm mà chúng ta không lường trước được cho sức khỏe đàn gia cầm cũng như của cộng đồng.
4.2. PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH VIRUS CÚM A/H9N2 TẠI MỘT SỐ TỈNH VIỆT NAM TỈNH VIỆT NAM
Đối với 423 mẫu bệnh phẩm swab và phủ tạng dương tính cúm H9 ở trên chúng tôi tiếp tục tiến hành phân lập bằng cách tiêm truyền trên trứng gà có phôi 9 ngày tuổi sau đó giám định lại các mẫu phân lập dương tính bằng phương pháp realtime RT-PCR. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả phân lập và giám định virus H9N2tại một số tỉnh Việt Nam
Stt Tỉnh Số mẫu phân lập Kết quả Số mẫu (+) HA Dương tính Newcastle (RRT-PCR) Dương tính H5N1 (RRT-PCR) Dương tính H9N2 (RRT-PCR) 1 Cao Bằng 92 7 0 0 7 2 Lào Cai 94 2 0 0 2 3 Bắc Ninh 80 5 0 0 5 4 Bắc Giang 62 0 0 0 0 5 Hà Nội 35 3 0 0 3 6 Hà Giang 60 3 0 0 3 Tổng 423 20 0 0 20
Kết quả bảng 4.2 cho thấy, trong tổng số 423 mẫu bệnh phẩm gây nhiễm lên phôi trứng gà có 20 mẫu phân lập và giám định dương tính với virus H9N2. Các mẫu bệnh phẩm còn lại không phân lập được nguyên nhân có thể do virus đã chết trong thời gian bảo quản và vận chuyển mẫu.
Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA Phản ứng realtime RT-PCR với gen H9
Hình 4.2. Hình ảnh một số phản ứng trong phân lập và giám định virus cúm A/H9N2 cúm A/H9N2
Từ 20 mẫu bệnh phẩm phân lập dương tính cúm H9N2, chúng tôi chọn ra 5 mẫu đại diện cho 5 khu vực, đặt tên cho từng chủng virus để tiến hành các nghiên