Phần 3 Nội dung, vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.4. Vật liệu nghiên cứu
- Cá chép giống ( Giai đoạn cá bột, cá hương, cá giống )
mổ, kính hiển vi, bình đong, ca nhựa, máy ảnh, sục khí, máy bơm,…
Hình 3.1: Bể composite, thùng xốp, bể kính
- Các dụng cụ, hóa chất trong phịng thí nghiệm: + Kính lúp, kính giải phẫu, kính hiển vi.
+ Bộ dụng cụ giải phẫu : dao liền cán cỡ vừa để cạo nhớt, dao cán liền để rạch cơ, dùi mũi nhọn để giải phẫu, kéo các loại. Ngồi ra cịn cần có các loại đồ đựng khác như : khay men, đĩa petri, cốc thủy tinh nhỏ, ống thủy tinh nhỏ, đĩa mặt đồng hồ, chén thủy tinh nhỏ.
+ Hóa chất gồm: cồn methylic, formalin, xylen, dung dịch Saudin, Gelatin – Glyxerin, nhựa bom Canada, nước cất.
- Các loại thuốc: Nova Parasite, Praziquantel, Sul-trime
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Áp dụng phương pháp nghiên cứu KST toàn diện ở cá của Dogiel (1929), được bổ sung cho phù hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam của tác giả: Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007).
3.5.1 Phƣơng pháp thu mẫu cá
Mẫu cá chép nuôi được thu theo phương pháp ngẫu nhiên. Mẫu cá thu theo các giai đoạn, số lượng mẫu được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Số lƣợng mẫu nghiên cứu TT Giai đoạn Số mẫu (con) Chiều dài TB (cm) Khối lƣợng (g) Hà Nội Bắc Ninh Hải Dƣơng 1 Cá bột 115 108 77 0,58 ± 0,06 0,012 ± 0,002 2 Cá hương 130 126 134 2,84 ± 0,14 0,48 ± 0,06 3 Cá giống 135 125 140 6,44 ± 0,42 9,36 ± 1,08 4 Cá thương phẩm 42 35 43 12,06 ± 0,61 15,8 ± 2,02 Tổng cộng 462 434 428
Cá sống thu từ các bể, ao, đầm ni cho vào túi bóng có bơm oxy điện đưa về phịng thí nghiệm để kiểm tra và phát hiện ký sinh trùng.
Trong quá trình thu mẫu cần ghi chép đầy đủ các thông tin: địa điểm, thời gian, số lượng cá, kích thước, yếu tố mơi trường tại nơi thu mẫu.
3.5.2. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU Thu mẫu:
Cá dùng để nghiên cứu là cá sống hoặc cá vừa mới chết, chưa bị khô nhớt, ít bị tổn thương do đánh bắt. (kỹ thuật giải phẫu cá)
Trên thân, vây có những nốt, nó là bao nang chứa đầy các bào tử của trùng bào tử có sợi tơ. Dùng dùi giải phẫu nhẹ nhàng lấy bào nang ra để vào lam kính sạch, thêm 1-2 giọt nước sạch cho bào nang khỏi khô. Đĩa petri đậy lại cho khỏi bụi.
Đưa các cung mang lên lam kính, xem cẩn thận bằng mắt thường, sau đó xem dưới kính hiển vi. Nếu phát hiện thấy bào nang thì lấy chúng ra để lên lam kính sạch khác, thêm 1-2 giọt nước và thực hiện các bước như trên. Trên mang, da, vây thường gặp các bào nang Myxobolus, Thelohanellus, Henneguya...Sau đó nghiên cứu tất cả các cơ quan bên trong, nếu phát hiện các
bào nang thì phải lấy riêng.
Hình 3.2: Sơ đồ tiến hành nghiên cứu ký sinh trùng
Nghiên cứu ký sinh trùng sống:
Cạo nhớt từ niêm mạc ruột đưa lên lam kính đậy lamen, xem dưới kính hiển vi, có thể gặp phơi amip và các bào tử. Bào tử rất nhỏ, bởi vậy chỉ có thể xem chúng dưới kính hiển 10x100. Khi phát hiện bào tử, vẽ cấu tạo, đo chiều dài, rộng, dày và các thông số khác.
Nghiên cứu KST trên cá chép
Thu mẫu cá ngẫu nhiên 50 – 100 con/đợt Nghiên cứu KST ký sinh trên cá chép Đo kích thước và khối lượng của cá
Tìm hiểu sơ bộ về mơi trường, điều kiện nuôi tại
nơi thu mẫu
Kiểm tra, phát hiện Thu thập, cố định, bảo quản Làm tiêu bản KST Đo, đếm và phân loại KST So sánh thành phần loài, mức độ nhiễm ở cá chép giống Xác định thành phần giống loài KST trên cá chép Kết luận và đề xuất ý kiến Đề xuất biện pháp phòng trị bệnh cho cá chép
Chuẩn bị tiêu bản cố định:
Các lam kính thu mẫu dùng dùi giải phẫu chọc thủng bào nang, các bào tử sẽ lan toả ra xung quanh. Để tiêu bản khơ trong khơng khí có thể nhuộm AgNO3 hoặc gắn tiêu bản ln. Dùng Gelatin-Glycerin (có thể cho thêm xanh Malachit để chống nấm phát triển) để làm tiêu bản. Khi lam kính vừa khơ, dùng dao nhỏ lấy một mẩu Gelatin- Glycerin vừa đủ, hơ nóng đưa lamen ra khỏi lam kính để ngửa sang một bên. Khi lamen nóng và chảy (chú ý không để sôi) trên ngọn đèn cồn. Cẩn thận đậy lamen lên, dùng dùi giải phẫu đè nhẹ đẩy hết bọt khí ra ngồi. Nếu làm tiêu bản tốt thì Gelatin-Glycerin vừa dàn đủ lamen. Để cho tiêu bản khỏi bị khô, xung quanh lamen bôi một lớp sơn dầu, Parafin hoặc nhựa bom Canada.
3.5.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ HÓA CHẤT VỚI NGOẠI KÝ SINH TRÙNG TRÊN CÁ CHÉP
3.5.3.1 Phƣơng pháp ngâm, tắm trên bể:
Bố trí thí nghiệm: cá giống bị thích bào tử trùng kí sinh trên mang, da
Bảng 3.2. Các nồng độ thuốc và hoá chất dùng để điều trị thử nghiệm thích bào tử trùng trên cá Chép giống bằng phƣơng pháp tắm
Thuốc, hóa chất và phương pháp dùng Số mẫu kiểm tra (con) Nồng độ thuốc hoá chất xử lý Ghi chú CuSO4 Tắm 30 3 ppm - Khi xử lý bằng phải bật sục khí liên tục, tránh làm cá bị ngạt do thiếu khí. - Phương pháp tắm: tắm cho cá trong thời gian 15–
30 phút. 30 4 ppm 30 5 ppm Formalin Tắm 30 200 ppm 30 250 ppm 30 300 ppm KMnO4 Tắm 30 10 ppm 30 15 ppm 30 20 ppm
Mỗi bể thí nghiệm ni 30 con cá Chép trong bể có thể tích 40x50x80 cm, các bể này được cung cấp nước giếng khoan và sục khí liên tục.
Lô 1: Cá nhiễm ký sinh trùng nuôi trong nước giếng khoan khơng có hóa chất
Lô 2: Cá nhiễm ký sinh trùng nuôi trong môi trường nước có pha thuốc thử nghiệm
Cá ở hai lô được nuôi và chăm sóc trong điều kiện giống nhau. Sau thời gian thí nghiệm, dùng vợt bắt cá ra tiến hành làm tiêu bản kiểm tra dưới kính hiển vi. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Lơ xử lý hóa chất và lơ đối chứng đều được chăm sóc như nhau trong cùng một điều kiện nhiệt độ 25 – 300C, sục khí liên tục. Nước sử dụng để thay hoàn tồn là nước giếng khoan, khơng dùng nước ao để tránh lây nhiễm các bệnh khác cho cá.
3.5.3.2. Phƣơng pháp cho cá ăn
Đối với những loại cá lớn hơn, không phù hợp với các phương pháp thử nghiệm trên bể, chúng tôi tiến hành thử nghiệm cho ăn đối với cá thương phẩm trực tiếp trên các ao nuôi, dựa trên cơ sở gợi ý của tác giả Kim Văn Vạn, 2013 nghiên cứu thử nghiệm điều trị ấu trùng sán lá ký sinh trên cá chép, chúng tôi tiến hành thử nghiệm điều trị bệnh thích báo tử trùng trên cá chép bằng các loại thuốc khác nhau như sau:
Stt Loại thuốc Hàm lượng Liệu
trình Ghi chú 1 Praziquantel 50mg/kg tt/ ngày 3 ngày Theo Kim Văn
Vạn, 2013
2 Nova parasite 4g/1kg thức ăn 2 ngày
Theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất
3 Sultrime 240 100g/50-70kg TĂ 3 ngày
Theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất
3.5.4. ĐO ĐẾM KÝ SINH TRÙNG 3.5.4.1. Tỷ lệ nhiễm (TLN).
Số cá nhiễm ký sinh trùng
TLN tb (%) = × 100 Tổng số cá kiểm tra
3.5.4.2. Cƣờng độ nhiễm (CĐN).
CĐN được đánh giá dựa vào số lượng và kích thước của ký sinh trùng. Tổng số KST CĐN tb = (trùng lớn và số lượng ít). Tổng số cá kiểm tra có KST Tổng số KST CĐN tb = (trùng nhỏ và số lượng ít). Tổng số lam (nhớt mang, nhớt ruột, nhớt da) kiểm tra có KST
Tổng số KST
CĐN tb = (trùng nhỏ, số lượng nhiều).
Tổng số thị trường kính kiểm tra
3.5.5. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU.
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel, 2007.
Sử dụng phương pháp thống kê sinh học để tính giá trị trung bình. Cơng thức tính giá trị trung bình:
n i i X n X 1 1 Trong đó: X : Giá trị trung bình.
Xi: số lượng trùng, kích thước cơ thể trùng đo lần thứ i n : số cá kiểm tra.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Myxobolus sp. Ký sinh ở hơn 30 loài cá nước ngọt Việt Nam, bệnh có thể
gặp ở mọi vùng nuôi cá, miền Bắc, Trung, Tây nguyên và Nam bộ, mức độ nhiễm Myxobolus ở một số loài cá khá cao và đã gây thành bệnh làm cá chết
hàng loạt, bệnh phát triển ở nhiệt độ nước cao 30 -320C, đàn cá chép giống bị bệnh thường có tỷ lệ tử vong rất cao.
Cá biển cũng thường gặp Myxobolus sp.. Chúng có khả năng ký sinh ở
nhiều cơ quan khác nhau: da, mang, ruột, não, tủy sống, mật...của cá.
Để xác định cá nhiễm Myxobolus sp. Tiến hành lấy nhớt các tổ chức nhiễm bệnh như mang, da, ruột... quan sát dưới KHV, để nhận biết các bào tử của
Myxobolus sp. ở độ phóng đại >400 lần.
4.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA TRÊN CÁC MẪU CÁ CHÉP 4.1.1. Kết quả kiểm tra trên cá chép bột 4.1.1. Kết quả kiểm tra trên cá chép bột
Việc tiến hành thu mẫu cá chép bột dựa trên Chính vụ sinh sản của cá chép vào tháng 2-4, tái phát dục và cho đẻ lại vào tháng 7-8. Với chu kỳ sinh sản như vậy, quá trình thu mẫu được tiến hành như sau: 150 mẫu cá bột được thu sau 4 lần ở 4 trại giống khác nhau trên địa bàn Bắc Ninh, Hải Dương, Hà Nội kiểm tra bằng phương pháp ép mô. Tất cả cá bột đều được thu trong bể ấp và bình Weys, nước chảy liên tục. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra Myxobolus sp. trên cá chép bột
STT Địa Điểm Đợt thu
mẫu (lần) Số cá (con) TLN (%) 1 Từ Sơn – Bắc Ninh 2 60 0 2 Đình Bảng – Bắc Ninh 2 60 0
3 Gia Lâm – Hà Nội 2 80 0
4 Phú Tảo – Hải Dương 2 100 0
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tơi đã thu 8 đợt (300 mẫu) và ở 4 địa điểm khác nhau. Qua kiểm tra, xét nghiệm chưa tìm thấy ký sinh trùng nói chung và Thích bào tử trùng Myxobolus sp. nói riêng, do sản xuất giống nhân tạo, trong quá trình ấp trứng nguồn nước đã được xử lý đảm bảo vệ sinh tốt nên cá bột không bị nhiễm Thích bào tử trùng.
Tác giả Trần Hải Thanh, 2014 đã nghiên cứu trên cá bột tại Hà Nội và vùng phụ cận cũng khơng thấy lồi Bào tử sợi nào trên cá bột. Báo cáo kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hồng Chiên, 2011 đã nghiên cứu tại Yên Thường , Gia Lâm , Hà Nội và trại nuôi cá của trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cũng cho kết quả giai đoạn cá này chưa nhiễm Thích bào tử trùng
Myxobolus sp..
4.1.2 Kết quả kiểm tra trên cá chép hƣơng
Sau 8 lần kiểm tra trên cá chép bột khơng phát hiện có thích bào tử trùng ký sinh, chúng tôi tiếp tục chuyển sang kiểm tra ở các giai đoạn khác trong vòng đời. Cá chép hương từ 2 tuần tuổi kích thước vẫn cịn nhỏ, phương pháp ép mô vẫn là phù hợp nhất để kiểm tra ký sinh trùng. Cịn đối với cá 3-4 tuần tuổi, kích thước lớn hơn cần phải chia cơ thể ra làm nhiều phần để kiểm tra. 450 mẫu cá được thu thập trên 16 ao tại các trại cá ở trên địa bàn tỉnh thành phố Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Dương. Sau đây là kết quả thu được.
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra trên cá chép hƣơng
Stt Giai đoạn (tuần tuổi) Số ao kiểm tra Số cá kiểm tra Số ao nhiễm Số cá nhiễm Tỷ lệ ao nhiễm (%) Tỷ lệ cá nhiễm TB (%) 1 1-2 8 250 0 0 0 0 2 3-4 8 200 2 38 25 19 Tổng 16 450 2 38 12,5 4,2
Cá chép hương từ dưới 2 tuần tuổi vẫn còn khá nhỏ, vậy nên chúng tơi khơng tiến hành đo kích thước. Ở giai đoạn này, các trại giống mới đưa cá ra ao, mật độ cá dày nên tiến hành thu mẫu bằng vợt. Các ao ương cá chép hương đều sử dụng ao đất, nguồn nước lấy vào ao ương chủ yếu lấy từ các nguồn nước thủy nông và đều có nhiễm nguồn nước thải chăn ni. Thậm chí chất thải chăn ni cịn được
đưa trực tiếp vào ao ương thơng qua lượng phân bón để gây màu nước ao. Kết quả kiểm tra cho thấy, khơng tìm thấy thích bào tử trùng trên cá hương giai đoạn từ 1-2 tuần tuổi, tỷ lệ nhiễm 0%. Nguyên nhân có thể do công tác chuẩn bị ao tốt, con giống khỏe mạnh, sạch bệnh, quản lý đươc môi trường nước giúp cho con vật được cách ly với mầm bệnh. Tuy nhiên việc nước quá sạch, nguồn thức ăn tự nhiên còn nghèo dẫn đến tốc độ tăng trưởng của cá con rất chậm.
Cá chép hương giai đoạn từ 3-4 tuần tuổi bắt đầu thấy sự xuất hiện của Thích bào tử trùng (Myxobolus sp.). Trong số 16 ao lấy mẫu cá kiểm tra có 2 ao ở Bắc Ninh và Hải Dương thấy sự xuất hiện Myxobolus sp., tỷ lệ cá nhiễm là
38 con trong tổng số 200 con kiểm tra chiếm tỷ lệ 19%, khơng tìm thấy cá chép nhiễm Thích bào tử trùng Myxobolus sp. ở những ao ương cá hương tại Hà Nội. Điều này cũng trùng với kết quả của tác giả Nguyễn Thị Hồng Chiên, 2011 đã nghiên cứu tại Yên Thường, Gia Lâm, Hà Nội và trại nuôi cá của trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội; và tác giả Trần Hải Thanh 2014 nghiên cứu ký sinh trùng bào tử sợi (Myxosporea). trên cá chép (Cyprinus carpio) ở Hà nội và vùng phụ cận cho kết quả các ao ương cá hương tại Hà Nội không nhiễm Thích bào tử trùng.
4.1.3. Kết quả kiểm tra trên cá chép giống
Sau khi ương cá chép hương khoảng 1 tháng cũng là thời điểm giao mùa, khi đó cá hương đạt kích cỡ 0,5-1g/con (1000-2000 con/kg) cá được các hộ dân chuyển từ các ao ương lên cá giống cấp 1 (cá giống nhỏ) rồi ương lên cá giống cấp 2,3 (cá giống lớn). Chúng tôi tiến hành thu thập và kiểm tra cá chép giống, và đây cũng là đối tượng chính của nghiên cứu. Kích cỡ của cá giống là lớn hơn nhiều so với cá hương và cá bột nên kiểm tra theo từng bộ phận của cơ thể cá.
Bảng 4.3: TLN thích bào tử trùng Myxobolus sp. trên cá giống
Loại cá giống Số ao kiểm tra (ao) Số ao nhiễm (ao) Tỷ lệ ao nhiễm (%) Số cá kiểm tra Số cá nhiễm (con) Tỷ lệ cá nhiễm (%) Cấp 1 6 2 33.3 180 40 22,2 Cấp 2 5 2 40 150 55 36,7 Cấp 3 4 0 0 124 0 0 Tổng 15 4 26,7 454 95 20,9±5,3
Nhìn vào bảng trên có thể thấy cá giống cấp 1 và cá giống cấp 2 tỷ lệ nhiễm thích bào tử trùng Myxobolus sp. khá cao. Đối với cá giống cấp 1, trên 6
ao kiểm tra, có 2 ao nhiễm, chiếm tỷ lệ 33,3%. Tỷ lệ cá giống cấp 1 nhiễm ký sinh trùng khá cao 40 con nhiễm trên tổng số 180 con kiểm tra chiếm 22,2%. Đối với cá giống cấp 2, trên 5 ao kiểm tra, có 2 ao nhiễm, chiếm tỷ lệ 40%. Tỷ lệ cá giống cấp 2 nhiễm ký sinh trùng là 55 con nhiễm trên tổng số 150 con kiểm tra chiếm 36,7%. Với những con số nêu trên cho thấy cá giống cấp 1 và cấp 2 là đối tượng rất dễ mắc bệnh Myxobolosis sau khi bị phơi nhiễm.
Triệu chứng cá nhiễm Thích bào tử trùng Myxobolus sp.: Cá kém ăn, bơi lội khơng bình thường, hay quẫy mạnh, cong đuôi, nổi lờ đờ trên mặt nước, ngáp nhiều. Cùng là một loại KST ký sinh trên cá giống nhưng lại có nhiều dạng biểu hiện khác nhau, các cơ quan đích khác nhau. Tiến hành kiểm tra trên cá xác định nhiễm Thích bào tử trùng về cơ quan kí sinh của Thích bào tử trùng
Bảng 4.4: Thích bào tử trùng ký sinh trên các cơ quan khác nhau của cá giống khác nhau của cá giống
Loại cá giống Số cá nhiễm (con) Cơ quan đích Da (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Mang