Từ tháng 11 năm 2017 đến tháng 08 năm 2018. 3.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành trên đàn lợn nái sinh sản giống Landrace đã đẻ từ 1 đến 4 lứa, lợn nái được nuôi tập trung tại một số trang trại quy mô từ 200 đến 2000 nái tại địa bàn 05 tỉnh khu vực đồng bằng Sông Hồng là: Hà Nội, Ninh Bình, Bắc Ninh, Hưng Yên và Hải Dương.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.3.2.1. Mẫu bệnh phẩm
Dịch tử cung ở lợn nái giống Landrace đã đẻ từ 1 đến 4 lứa mắc bệnh sinh sản và lợn nái không mắc bệnh sinh sản được nuôi tập trung tại một số trang trại tại địa bàn 05 tỉnh khu vực đồng Sông Hồng là: Hà Nội, Ninh Bình, Bắc Ninh, Hưng Yên và Hải Dương.
3.3.2.2. Hóa chất
+ Dung dịch Rivanol 0.1% , Lugol 0.1%. + Thuốc kháng sinh tiêm Norfloxacin. + Dung dịch nước sinh lý 0.85%. + Thuốc bổ tiêm ADE. Bcomplex.
+ Dung dịch Hormone tiêm Oxytocin, Lutalyze dẫn xuất của PGF2α
3.3.2.3. Môi trường nuôi cấy và phân lập
+ Môi trường phổ thông: Môi trường nước thịt, môi trường thạch thường: Kiểm tra khuẩn lạc, làm kháng sinh đồ.
Môi trường Sapman: Phân lập và xác định độc lực Staphylococcus
Môi trường Brilliant Green Agar: Phân lập E. coli và Salmonella
Môi trường Edwwards medium: Phân lập Streptococcus
Môi trường Cetrimide: Phân lập Pseudomonas
Môi trường thạch máu: Giữ và bảo quản vi khuẩn
3.3.2.4. Giấy tẩm kháng sinh
Các mảnh giấy chuẩn đã được tẩm kháng sinh theo đúng tiêu chuẩn Quốc tế do hãng Oxoid – Anh sản xuất
Các thuốc kháng sinh dùng để tẩm đều đạt tiêu chuẩn dược điển Việt Nam 1994.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
-Theo dõi tỷ lệ mắc một số bệnh sinh sản thường gặp trên đàn lợn nái ngoại nuôi tại một số trang trại thuộc khu vực đồng bằng sông Hồng bao gồm:
Bệnh viêm tử cung, bệnh viêm vú, hội chứng mất sữa và hiện tượng đẻ khó.
-Xác định ảnh hưởng của bệnh sinh sản đến một số chỉ tiêu sinh sản của lợn nái ngoại nuôi tại một số trang trại thuộc khu vực đồng bằng sông Hồng
+ Thời gian động dục lại của lợn nái sau cai sữa lợn con (ngày) + Số con động dục trở lại (con). Tỷ lệ đông dục trở lại (%)
+ Số con đậu thai trong lần phối giống đầu tiên (con). Tỷ lệ phối giống đậu thai ở lần phối giống đầu tiên (%)
+ Số lợn con sinh ra/ổ (con). Số lợn con sinh ra còn sống tới 24h (con) + Số lợn con cai sữa/ổ (con). Trọng lượng lợn con cai sữa ở 21 ngày tuổi (kg/con).
-Xác định ảnh hưởng của lợn mẹ bị bệnh sinh sản đến tỷ lệ mắc hội chứng tiêu chảy ở lợn con
-Xác định sự biến đổi vi khuẩn trong dịch tử cung của lợn nái mắc bệnh sinh sản:
+Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của lợn nái bình thường và lợn nái mắc bệnh sinh sản.
+Thành phần vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của lợn nái bình thường và lợn nái mắc bệnh sinh sản.
+Xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của một số loại vi khuẩn phân lập được từ dịch tử cung của lợn nái mắc bệnh sinh sản.
+Xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các vi khuẩn có trong dịch tử cung của lợn nái mắc bệnh sinh sản.
-Thử nghiệm điều trị bệnh viêm tử cung bằng một số phác đồ khác nhau và theo dõi chỉ tiêu tỷ lệ khỏi, thời gian khỏi và khả năng sinh sản của lợn nái sau khi khỏi bệnh.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp điều tra, phỏng vấn trực tiếp người chăn nuôi kết hợp với việc quan sát, theo dõi, thăm khám trực tiếp nhằm xác định lợn nái ngoại giống việc quan sát, theo dõi, thăm khám trực tiếp nhằm xác định lợn nái ngoại giống Landrace bị bệnh sinh sản: Bệnh viêm tử cung, bệnh viêm vú, hiện tượng đẻ khó và hội chứng mất sữa.
Điều tra phỏng vấn trực tiếp người chăn nuôi: Biểu hiện lợn nái trước, trong, sau quá trình đẻ. Biểu hiện trong giai đoạn nuôi con của lợn nái, biểu hiện đàn lợn con theo mẹ. Thăm khám lợn nái mắc bệnh sinh sản: Đo thân nhiệt lợn nái sáng, chiều, tính giá trị trung bình. Quan sát biểu hiện của lợn nái, quan sát dịch tử cung, kiểm tra cổ tử cung bằng mỏ vịt, quan sát bên ngoài lợn nái: Quan sát bầu vú, vắt sữa, kiểm tra lợn con có tư thế sai trong quá trình đẻ, kiểm tra sức khỏe lợn con: Thân nhiệt, hệ tiêu hóa, hô hấp...
Chỉ tiêu đánh giá lợn nái viêm tử cung: Lợn nái bỏ ăn, sốt cao 40-410, vật đau đớn, cong lưng rặn, từ âm hộ chảy ra hỗn dịch, niêm dịch, dịch viêm mủ lợn cợn. Kiểm tra cổ tử cung thấy hơi mở, có mủ chảy ra. Xung quanh gốc đuôi, hai bên mông dính nhiều dịch viêm, khô lại thành đám, vảy...có mùi tanh, thối.
Chỉ tiêu đánh giá lợn nái viêm vú: Núm vú sưng to, lợn mẹ giảm ăn hoặc bỏ ăn, đầu vú sưng to, nóng, lợn có cảm giác đau, không cho con bú, sốt 40-410. Vắt sữa từ vú được hỗn dịch có mủ lợn cợn, có mùi hôi.
Chỉ tiêu đánh giá lợn nái mất sữa: Lợn nái bỏ ăn, thích nằm, lợn mê man, mũi khô, da tái, ít đi tiểu, thân nhiệt hạ. Bầu vú căng to nhưng không có sữa, lợn con bú nhưng không no, kêu liên tục, gầy sút.
Chỉ tiêu đánh giá lợn nái đẻ khó: Lợn rặn nhiều lần, thời gian lâu mà không đẻ được, rặn đẻ thưa dần, lợn nái mệt mỏi, khó chịu, nước ối có máu, kiểm tra qua tử cung thấy lợn con vướng ở xương chậu.
3.5.2.Phương pháp theo dõi lợn nái động dục sau cai sữa bằng cách trao đổi với người chăn nuôi, đồng thời trực tiếp thử nghiệm sự lên giống của lợn nái sau cai sữa
Tại đề tài này, chúng tôi theo dõi lợn nái trong thời gian 07 ngày. Những lợn nái lên giống sau 07 ngày được coi là không lên giống. Sau thời gian trên chúng tôi vẫn tiếp tục theo dõi đến 02 chu kì, số lợn nái lên giống trong khoảng thời gian đó vẫn tiếp tục đưa vào sản xuất, số lợn nái lên giống ngoài khoảng thời gian đó mang đi loại thải.
Chỉ tiêu đánh giá lợn nái động dục trở lại: Lợn nái bỏ ăn, phá chuồng, âm hộ sưng mọng, đỏ hồng, căng bóng, nước nhờn, keo dính chảy ra từ âm hộ, kiểm tra lợn cái bằng cách dùng hai tay xoa vuốt từ hàng vú cuối lên lưng của lợn sau đó ấn lên lưng của lợn hoặc dùng lợn đực thí tình, lợn nái đứng ì, hai tai vểnh lên, tư thế sẵn sàng cho lợn đực phối.
3.5.3. Phương pháp theo dõi trực tiếp kết hợp trao đổi với người chăn nuôi các chỉ tiêu sinh sản của lợn nái nhằm xác định ảnh hưởng của bệnh sinh các chỉ tiêu sinh sản của lợn nái nhằm xác định ảnh hưởng của bệnh sinh sản đến một số chỉ tiêu sinh sản của lợn nái giống Landrace
Lợn nái mắc bệnh sinh sản đã được điều trị khỏi theo phác đồ của trang trại và được theo dõi các chỉ tiêu sinh sản sau khi đẻ: Dùng kháng sinh Amoxicillin 1ml/10kgP, thuốc hạ sốt Anagil C 10ml/con, thuốc trợ sức trợ lực B- complex 10ml/con, thụt rửa tử cung bằng dung dịch sát trùng Iodin 10% pha với 1 lít nước sạch, liệu trình điều trị 3-5 ngày, lợn nái đã ăn uống trở lại, không còn dịch viêm chảy ra từ âm hộ, sữa đã trong, không có cặn sữa, bầu vú đã hết sưng nóng.
Các chỉ tiêu theo dõi lợn nái được ghi chép lại và xử lí trong phần mềm Excel.
3.5.4. Phương pháp theo dõi ảnh hưởng của lợn nái mắc bệnh sinh sản đến hội chứng tiêu chảy ở lợn con. chứng tiêu chảy ở lợn con.
Những con lợn con theo mẹ mắc hội chứng tiêu chảy, chúng tôi đánh dấu bằng mực trên lưng, tiện cho việc theo dõi, quan sát. Những con lợn con này vẫn được nhốt chung với lợn mẹ trong quá trình theo dõi.
Chỉ tiêu đánh giá lợn con mắc hội chứng tiêu chảy: Lợn con mất nước, bỏ bú, nôn ra dịch vàng, sữa vón cục xanh vàng, mùi sữa nôn tanh hôi khó chịu, da nhăn nheo, đi lại loạng choạng, thân nhiệt giảm, gầy sút, thường nằm một chỗ, gốc đuôi hay phần sau dính phân.
3.5.5.Phương pháp lấy mẫu, xử lí mẫu dịch tử cung lợn nái
3.5.5.1. Phương pháp lấy mẫu
+Mẫu dịch tử cung được lấy sau khi lợn nái sinh xong khoảng 12-24 giờ. +Mang găng tay, dùng bông gòn thấm cồn 700 , lau sạch bên ngoài âm hộ. +Dùng mỏ vịt mở âm hộ sau đó đưa ống vô trùng vào âm đạo.
+Đưa ống thụt có nối với Seringe đưa qua cổ tử cung hút lấy dịch tử cung cho vào ống nghiệm.
+Cho ống nghiệm đựng mẫu vào thùng đá bảo quản quản trong thùng xốp có đá ở 40C, nhanh chóng đưa về phòng thí nghiệm theo tiêu chuẩn ISO – 17205 để đếm vi khuẩn hiếu khí, phân lập và thử kháng sinh đồ.
3.5.5.2. Phương pháp xử lí mẫu
Mẫu lấy về chưa kịp xử lí sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 40
Xử lí mẫu: Mẫu lấy về cấy chuyển vào môi trường nước thịt, thạch thường, đặt trong tủ ẩm 370C/24h lấy ra quan sát hình thái, kích thước và dạng khuẩn lạc. Từ đó sơ bộ định loại vi khuẩn.
-Phương pháp xử lí mẫu nhằm đếm số vi khuẩn hiếu khí:
+Mẫu xét nghiệm cần pha loãng đến mức độ cần thiết. Sau nhiều lần cấy mẫu với các độ pha loãng khác nhau, chúng tôi xác định được độ pha loãng thích hợp với các mẫu bệnh phẩm như sau:
+Dịch tử cung ở lợn sau đẻ là: 10-4
+Dịch tử cung ở lợn mắc bệnh sinh sản là: 10-7
+Đếm tổng số khuẩn lạc trên một đĩa thạch và quy đổi trong 1ml dịch tử cung
+Sau khi pha loãng, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn vào thạch đĩa.
+Mỗi mẫu xét nghiệm được đưa vào 2 đĩa thạch thường và đĩa thạch phân lập, mỗi đĩa thạch được cấy 0.1ml dịch và đánh số. Tất cả được để trong tủ ấm 370C/24h. Sau đó đếm số khuẩn lạc có trong các đĩa ở môi trường thạch thường và thạch chuyên dụng. Số vi khuẩn trong 1ml dịch mẫu được tính theo công thức:
X=10.A.N
A: Số khuẩn lạc trung bình trên 1 đĩa N: Độ pha loãng
Để đếm được tổng số các loại vi khuẩn có trong dịch nghiên cứu, chúng tôi dùng môi trường thạch thường để đếm tổng số các loại vi khuẩn có trong một đĩa thạch ở độ pha loãng thích hợp. Đồng thời chúng tôi còn sử dụng các môi trường chuyên dụng sau để đếm các loại vi khuẩn có mặt chủ yếu ở tử cung lợn mắc bệnh sinh sản.
Môi trường Sapman dùng đếm vi khuẩn Staphylococcus spp
Môi trường Edwards medium dùng đếm vi khuẩn Streptococcus spp
Môi trường Brillant dùng đếm vi khuẩn E. coli và Salmonella spp
Môi trường Cetrimide dùng đếm vi khuẩn Pseudomonas spp
Tổng số khuẩn lạc có trong 2 đĩa thạch trên phải nhỏ hơn hay bằng tổng số khuẩn lạc có trên đĩa thạch thường ở cùng một nồng độ pha loãng.
-Phương pháp xử lí mẫu nhằm phân lập xác định vi khuẩn:
Mỗi loại vi khuẩn, khi mọc trên môi trường có thể sẽ hình thành một loại khuẩn lạc có kích thước, hình dáng và màu sắc riêng biệt như:
Staphylococcus spp: Khuẩn lạc dạng S, rìa gọn, tròn, mặt lồi, láng bóng có màu vàng rơm nếu là Staphylococcus aureus.
Streptococcus spp: Khuẩn lạc dạng S, nhỏ, màu hơi xám, bóng.
Salmonella spp: Khuẩn lạc dạng S, có thể có dạng R, khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa.
E. coli: Khuẩn lạc dạng S, có thể có dạng R, khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro, trắng nhạt, hơi lồi.
Pseudomonas spp: Khuẩn lạc trong, bờ đều hoặc không đều, màu xám nhạt có ánh kim, có khuynh hướng mọc lan tràn
Sau khi xác định được các loại khuẩn lạc khác nhau, mỗi loại khuẩn lạc lại tiến hành phết kính, nhuộm gram để xem hình thái, tính chất bắt màu và cấu trúc của vi khuẩn:
Staphylococcus spp: Bắt màu gram dương, hình cầu, tụ lại hình chùm nho.
Streptococus spp: Bắt màu gram dương, có hình cầu hoặc trứng, đứng riêng lẽ hoặc chuỗi.
Salmonella spp: bắt màu gram âm, trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn.
E. coli: Bắt màu gram âm, trực khuẩn ngắn, bắt màu thẫm ở hai đầu.
Pseudomonas spp: Bắt màu gram âm, có lông di động, không có vỏ. Khuẩn lạc được tách thuần khiết, cấy vào môi trường phân lập, để xác định tính chất mọc của chúng trong các môi trường này
Môi trường Sapman: Staphylococcus spp khuẩn lạc to, rìa gọn. Nếu là tụ cầu gây bệnh thì môi trường biến thành màu vàng, tụ cầu không gây bệnh thì môi trường giữ nguyên màu đỏ.
Môi trường Edwards: Streptococcus spp khuẩn lạc nhỏ, mặt hơi lồi, mịn, rìa gọn.
Môi trường Brilliant : E. coli làm môi trường biến màu vàng chanh,
Salmonella làm môi trường có màu đỏ.
Môi trường Cetrimide: Pseudomonasspp tỏa ra mùi thơm đặc biệt do sinh ra Kimetylamin.
Cuối cùng, cấy chuyển thạch máu giữ giống để giám định tiếp nếu cần.
-Phương pháp xử lí mẫu nhằm thử tính mẫn cảm của vi khuẩn phân lập được và tập đoàn vi khuẩn trong dịch tử cung của lợn nái với một số loại kháng sinh.
+Dùng tampon vô khuẩn nhúng vào huyễn dịch rồi lấy lên ép nhẹ và xoay nhẹ que gòn trên thành ống nghiệm
+Ria vi khuẩn lên mặt thạch. Chờ thạch khô trong 3-5 phút
+Dùng pank vô trùng đặt các mảnh giấy kháng sinh đặt cách nhau không dưới 24mm. Sau khi đặt các mảnh giấy vào đĩa thạch được khoảng 15 phút, đặt đĩa thạch vào tủ ấm 370 sau 16-18h lấy ra đọc kết quả, lúc đó vi khuẩn sẽ mọc thành những khóm mịn tiếp hợp nhau và vòng vô khuẩn là một vòng tròn đồng nhất.
+Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước có đơn vị mm, bằng cách ép thước lên mặt sau của đáy hộp thạch. Nếu cạnh của vòng ức chế không rõ nét thì phải đo chỗ hẹp nhất và chỗ rộng nhất rồi lấy giá trị trung bình. Đường kính của vòng vô khuẩn được tính ra mm. Nếu khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập và thử lại.
năng sinh sản của lợn nái sau khi được điều trị lành bệnh bằng 3 phác đồ điều trị thử nghiệm:
Thử nghiệm được thực hiện trên 90 lợn nái mắc bệnh sinh sản. Trong số nái điều trị, nái đẻ lứa đầu và các lứa đẻ sau được chia đều cho 3 lô. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Tỷ lệ khỏi bệnh, thời gian điều trị, tỷ lệ động dục trở lại sau khi tách lợn con, tỷ lệ thụ thai ở lần phối đầu tiên sau khi khỏi bệnh được chúng tôi trực tiếp theo dõi và ghi chép lại.
Phác đồ 1: Thụt rửa tử cung bằng dung dịch Rivanol 0,1% ngày 1 lần, sau khi thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng
Norfloxacin 5mg/kg thể trọng pha với 100ml nước sinh lý bơm vào tử cung; kết hợp trợ sức trợ lực bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
Phác đồ 2:Dùng 4ml Oxytocin tiêm dưới da, thụt rửa tử cung 500ml dung dịch Lugol 0,1%, dùng Norfloxacin 5mg/kg thể trọng pha với 100ml nước sinh lý bơm vào tử cung; kết hợp trợ sức trợ lực bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
Phác đồ 3: Dùng Lutalyze một dẫn xuất của PGF2α tiêm dưới da 2ml (25mg), tiêm 1 lần; thụt rửa tử cung 500ml dung dịch Lugol 0,1%, dùng Norfloxacin 5mg/kg thể trọng pha với 100ml nước sinh lý bơm vào tử cung; kết hợp trợ sức trợ lực bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
3.6. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Tất cả các số liệu đều được theo dõi, ghi chép, và xử lí bằng phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel. Các phép so sánh về tỷ lệ đều được thực