3.5.5.1. Phương pháp lấy mẫu
+Mẫu dịch tử cung được lấy sau khi lợn nái sinh xong khoảng 12-24 giờ. +Mang găng tay, dùng bông gòn thấm cồn 700 , lau sạch bên ngoài âm hộ. +Dùng mỏ vịt mở âm hộ sau đó đưa ống vô trùng vào âm đạo.
+Đưa ống thụt có nối với Seringe đưa qua cổ tử cung hút lấy dịch tử cung cho vào ống nghiệm.
+Cho ống nghiệm đựng mẫu vào thùng đá bảo quản quản trong thùng xốp có đá ở 40C, nhanh chóng đưa về phòng thí nghiệm theo tiêu chuẩn ISO – 17205 để đếm vi khuẩn hiếu khí, phân lập và thử kháng sinh đồ.
3.5.5.2. Phương pháp xử lí mẫu
Mẫu lấy về chưa kịp xử lí sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 40
Xử lí mẫu: Mẫu lấy về cấy chuyển vào môi trường nước thịt, thạch thường, đặt trong tủ ẩm 370C/24h lấy ra quan sát hình thái, kích thước và dạng khuẩn lạc. Từ đó sơ bộ định loại vi khuẩn.
-Phương pháp xử lí mẫu nhằm đếm số vi khuẩn hiếu khí:
+Mẫu xét nghiệm cần pha loãng đến mức độ cần thiết. Sau nhiều lần cấy mẫu với các độ pha loãng khác nhau, chúng tôi xác định được độ pha loãng thích hợp với các mẫu bệnh phẩm như sau:
+Dịch tử cung ở lợn sau đẻ là: 10-4
+Dịch tử cung ở lợn mắc bệnh sinh sản là: 10-7
+Đếm tổng số khuẩn lạc trên một đĩa thạch và quy đổi trong 1ml dịch tử cung
+Sau khi pha loãng, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn vào thạch đĩa.
+Mỗi mẫu xét nghiệm được đưa vào 2 đĩa thạch thường và đĩa thạch phân lập, mỗi đĩa thạch được cấy 0.1ml dịch và đánh số. Tất cả được để trong tủ ấm 370C/24h. Sau đó đếm số khuẩn lạc có trong các đĩa ở môi trường thạch thường và thạch chuyên dụng. Số vi khuẩn trong 1ml dịch mẫu được tính theo công thức:
X=10.A.N
A: Số khuẩn lạc trung bình trên 1 đĩa N: Độ pha loãng
Để đếm được tổng số các loại vi khuẩn có trong dịch nghiên cứu, chúng tôi dùng môi trường thạch thường để đếm tổng số các loại vi khuẩn có trong một đĩa thạch ở độ pha loãng thích hợp. Đồng thời chúng tôi còn sử dụng các môi trường chuyên dụng sau để đếm các loại vi khuẩn có mặt chủ yếu ở tử cung lợn mắc bệnh sinh sản.
Môi trường Sapman dùng đếm vi khuẩn Staphylococcus spp
Môi trường Edwards medium dùng đếm vi khuẩn Streptococcus spp
Môi trường Brillant dùng đếm vi khuẩn E. coli và Salmonella spp
Môi trường Cetrimide dùng đếm vi khuẩn Pseudomonas spp
Tổng số khuẩn lạc có trong 2 đĩa thạch trên phải nhỏ hơn hay bằng tổng số khuẩn lạc có trên đĩa thạch thường ở cùng một nồng độ pha loãng.
-Phương pháp xử lí mẫu nhằm phân lập xác định vi khuẩn:
Mỗi loại vi khuẩn, khi mọc trên môi trường có thể sẽ hình thành một loại khuẩn lạc có kích thước, hình dáng và màu sắc riêng biệt như:
Staphylococcus spp: Khuẩn lạc dạng S, rìa gọn, tròn, mặt lồi, láng bóng có màu vàng rơm nếu là Staphylococcus aureus.
Streptococcus spp: Khuẩn lạc dạng S, nhỏ, màu hơi xám, bóng.
Salmonella spp: Khuẩn lạc dạng S, có thể có dạng R, khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa.
E. coli: Khuẩn lạc dạng S, có thể có dạng R, khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro, trắng nhạt, hơi lồi.
Pseudomonas spp: Khuẩn lạc trong, bờ đều hoặc không đều, màu xám nhạt có ánh kim, có khuynh hướng mọc lan tràn
Sau khi xác định được các loại khuẩn lạc khác nhau, mỗi loại khuẩn lạc lại tiến hành phết kính, nhuộm gram để xem hình thái, tính chất bắt màu và cấu trúc của vi khuẩn:
Staphylococcus spp: Bắt màu gram dương, hình cầu, tụ lại hình chùm nho.
Streptococus spp: Bắt màu gram dương, có hình cầu hoặc trứng, đứng riêng lẽ hoặc chuỗi.
Salmonella spp: bắt màu gram âm, trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn.
E. coli: Bắt màu gram âm, trực khuẩn ngắn, bắt màu thẫm ở hai đầu.
Pseudomonas spp: Bắt màu gram âm, có lông di động, không có vỏ. Khuẩn lạc được tách thuần khiết, cấy vào môi trường phân lập, để xác định tính chất mọc của chúng trong các môi trường này
Môi trường Sapman: Staphylococcus spp khuẩn lạc to, rìa gọn. Nếu là tụ cầu gây bệnh thì môi trường biến thành màu vàng, tụ cầu không gây bệnh thì môi trường giữ nguyên màu đỏ.
Môi trường Edwards: Streptococcus spp khuẩn lạc nhỏ, mặt hơi lồi, mịn, rìa gọn.
Môi trường Brilliant : E. coli làm môi trường biến màu vàng chanh,
Salmonella làm môi trường có màu đỏ.
Môi trường Cetrimide: Pseudomonasspp tỏa ra mùi thơm đặc biệt do sinh ra Kimetylamin.
Cuối cùng, cấy chuyển thạch máu giữ giống để giám định tiếp nếu cần.
-Phương pháp xử lí mẫu nhằm thử tính mẫn cảm của vi khuẩn phân lập được và tập đoàn vi khuẩn trong dịch tử cung của lợn nái với một số loại kháng sinh.
+Dùng tampon vô khuẩn nhúng vào huyễn dịch rồi lấy lên ép nhẹ và xoay nhẹ que gòn trên thành ống nghiệm
+Ria vi khuẩn lên mặt thạch. Chờ thạch khô trong 3-5 phút
+Dùng pank vô trùng đặt các mảnh giấy kháng sinh đặt cách nhau không dưới 24mm. Sau khi đặt các mảnh giấy vào đĩa thạch được khoảng 15 phút, đặt đĩa thạch vào tủ ấm 370 sau 16-18h lấy ra đọc kết quả, lúc đó vi khuẩn sẽ mọc thành những khóm mịn tiếp hợp nhau và vòng vô khuẩn là một vòng tròn đồng nhất.
+Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước có đơn vị mm, bằng cách ép thước lên mặt sau của đáy hộp thạch. Nếu cạnh của vòng ức chế không rõ nét thì phải đo chỗ hẹp nhất và chỗ rộng nhất rồi lấy giá trị trung bình. Đường kính của vòng vô khuẩn được tính ra mm. Nếu khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập và thử lại.
năng sinh sản của lợn nái sau khi được điều trị lành bệnh bằng 3 phác đồ điều trị thử nghiệm:
Thử nghiệm được thực hiện trên 90 lợn nái mắc bệnh sinh sản. Trong số nái điều trị, nái đẻ lứa đầu và các lứa đẻ sau được chia đều cho 3 lô. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Tỷ lệ khỏi bệnh, thời gian điều trị, tỷ lệ động dục trở lại sau khi tách lợn con, tỷ lệ thụ thai ở lần phối đầu tiên sau khi khỏi bệnh được chúng tôi trực tiếp theo dõi và ghi chép lại.
Phác đồ 1: Thụt rửa tử cung bằng dung dịch Rivanol 0,1% ngày 1 lần, sau khi thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng
Norfloxacin 5mg/kg thể trọng pha với 100ml nước sinh lý bơm vào tử cung; kết hợp trợ sức trợ lực bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
Phác đồ 2:Dùng 4ml Oxytocin tiêm dưới da, thụt rửa tử cung 500ml dung dịch Lugol 0,1%, dùng Norfloxacin 5mg/kg thể trọng pha với 100ml nước sinh lý bơm vào tử cung; kết hợp trợ sức trợ lực bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
Phác đồ 3: Dùng Lutalyze một dẫn xuất của PGF2α tiêm dưới da 2ml (25mg), tiêm 1 lần; thụt rửa tử cung 500ml dung dịch Lugol 0,1%, dùng Norfloxacin 5mg/kg thể trọng pha với 100ml nước sinh lý bơm vào tử cung; kết hợp trợ sức trợ lực bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
3.6. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Tất cả các số liệu đều được theo dõi, ghi chép, và xử lí bằng phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel. Các phép so sánh về tỷ lệ đều được thực hiện bằng phương pháp Khi bình phương. Các phép so sánh thời gian động dục lại sau cai sữa, trọng lượng lợn con sau cai sữa thực hiện bằng phương pháp student – t test. Các phép so sánh thời gian điều trị, thời gian động dục lại được so sánh bằng phương pháp One way ANOVA trong phần mềm SPSS, phiên bản 22.