Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4.1.Khảo sát đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng trong vụ Thu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1.Khảo sát đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng trong vụ Thu
2. Đánh giá khả năng chịu nóng của dòng, giống cà chua;
3. Xác định khả năng chứa gen kháng bệnh xoăn vàng lá Ty-1, Ty-2, Ty-3 và Ty-4 của dòng, giống cà chua thí nghiệm;
4. Đánh giá khả năng kháng bệnh xoăn vàng lá bằng lây nhiễm nhân tạo.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Khảo sát đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng trong vụ Thu đông 2017 và Xuân hè 2018 Thu đông 2017 và Xuân hè 2018
- Thời vụ trồng: Vụ Thu đông (Thí nghiệm 1): Gieo hạt 5/10 trồng 31/10 Vụ Xuân hè (Thí nghiệm 2): Gieo hạt 6/3 trồng 26/3
- Gieo cây con: Gieo vào bầu thành phần giá thể gồm 50% đất phù sa + 35% (xơ dừa, trấu hun) + 15% (mùn mục). Giá thể được xử lý sạch bệnh và chuẩn bị trước khi sử dụng 5-10 ngày. Khi cây cao được 8-10 cm, có 4-5 lá thật, thân cứng, mập, không bị sâu, bệnh hại thì đem trồng.
- Chuẩn bị đất và trồng cây
+ Đất trồng: Đất được chọn là đất trồng giàu mùn, tơi xốp, dễ thoát nước, độ pH 5,5-7.
Luống trồng rộng 1,5 m, cao 25cm, mặt luống rộng 110cm, rãnh luống rộng 30cm.
+ Khoảng cách trồng: Cây x cây 45 cm, hàng x hàng 75 cm. Diện tích ô thí nghiệm 10m2, trồng 32 cây.
- Phân bón
* Lượng phân và cách bón: (lượng phân tính cho 1 ha)
STT Loại phân Tổng số phân Bón lót Lần 1 Bón thúc Lần 2 Lần 3
1 Phân hữu cơ (tấn) 10 10
2 Đạm urê (kg) 350 80 170 100
3 Lân supe (kg) 750 600 150
4 Kali sunfat (kg) 300 60 170 70
+ Bón lót: Đánh rạch và bón phân hữu cơ, lân, vôi bột vào hốc (rạch), đảo đều với đất và lấp đất trước khi trồng 2 - 3 ngày.
+ Bón thúc lần 1: Sau trồng 10 - 15 ngày, kết hợp với vun đợt 1 + Bón thúc lần 2 : Sau trồng 30 - 35 ngày, kết hợp với vun cao đợt 2 + Bón thúc lần 3 : Sau khi thu quả lần đầu.
- Kỹ thuật chăm sóc
Luôn giữ ẩm cho cây, nhất là ở giai đoạn đầu và giai đoạn ra hoa kết quả tưới rãnh để giữ ẩm. Sau khi trồng khoảng 25-30 ngày làm giàn chữ A để chống đổ cho cây
Sơ đồ bố trí thí nghiệm vụ Thu đông 2017
Dải bảo vệ Dải bảo vệ Dải bảo vệ 6 11 5 1 13 7 4 ĐC2 3 14 10 12 15 2 8 9 ĐC1 10 5 8 3 ĐC1 9 11 13 4 14 12 2 1 7 6 15 ĐC2 4 2 10 3 1 12 9 8 13 14 ĐC2 5 ĐC1 11 6 7 15 Dải bảo vệ
Sơ đồ bố trí thí nghiệm vụ Xuân hè 2018
Dải bảo vệ Dải bảo vệ Dải bảo vệ 11 10 5 2 3 6 1 ĐC1 15 7 14 4 9 8 13 12 ĐC2 4 2 8 1 6 ĐC2 13 10 15 12 5 11 ĐC1 3 14 9 7 8 4 2 ĐC1 12 10 3 6 5 9 ĐC2 15 11 13 14 1 7 Dải bảo vệ 3.4.2. Các chỉ tiêu theo dõi
* Các giai đoạn sinh trưởng của cây cà chua trên đồng ruộng
- Thời gian từ gieo đến mọc (ngày): Tính từ lúc gieo cây cho đến khi có 50% số cây mọc
- Thời gian từ mọc đến ra lá thật (ngày): 50% số cây ra lá thật
- Thời gian từ trồng đến ra hoa đầu (ngày): 50% số cây ra hoa đầu tiên - Thời gian từ trồng đến đậu quả đầu (ngày): 50% số cây đậu quả đầu - Thời gian từ trồng đến thu quả lứa đầu (ngày)
- Tổng thời gian sinh trưởng (ngày): Được tính bằng số ngày từ khi mọc đến ngày kết thúc thu hoạch.
* Một số đặc điểm về hình thái
- Màu sắc thân - Màu sắc lá
- Hình dạng phiến lá
- Dạng hình chùm hoa: đơn giản (chỉ có một trục chính, hoa mọc so le trên trục), trung gian (hoa ra 2 nhánh chính) và phức tạp (chùm hoa chia thành nhiều nhánh).
- Hình dạng và màu sắc quả
* Một số chỉ tiêu sinh trưởng và cấu trúc cây
- Dạng hình sinh trưởng:
+ Dạng hình sinh trưởng hữu hạn: Khi cây phát triển đến độ cao khoảng 65 cm, chùm hoa thứ nhất thường xuất hiện. Khi trên thân chính có 7-8 lá thật cứ 1-2 lá có chùm hoa kế tiếp, cho đến khi có 3-4 chùm thì đỉnh sinh trưởng có chùm hoa cuối cùng, cây ngừng sinh trưởng chiều cao.
+ Dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn: Cây có độ cao 65-120 cm, khi trên thân chính có 7-8 lá thật thì xuất hiện chùm hoa thứ nhất, sau đó cứ cách 1-2 lá thì có chùm hoa tiếp theo cho đến khi thân chính có tới 7-8 chùm hoa thì chiều cao ngừng sinh trưởng.
+ Dạng hình sinh trưởng vô hạn: cây cao trên 120 cm, khoảng cách giữa các lóng dài, vị trí chùm hoa thứ nhất cao, khi trên thân chính có 9- 10 lá thật thì xuất hiện chùm hoa thứ nhất. Sau đó cứ cách 2-3 lá có chùm hoa tiếp theo sau đó cứ tiếp tục như vậy cho đến khi cây già hoặc không đủ các yếu tố nước, dinh dưỡng…thì cây ngừng sinh trưởng.
- Chiều cao từ gốc đến chùm hoa thứ nhất (cm).
- Chiều cao cuối cùng trên thân chính (cm): đo từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng thân chính
- Số chùm hoa trên thân chính và thân phụ - Số hoa trung bình/chùm
- Tổng số hoa/cây
* Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất
- Tổng số quả/cây (quả): đếm số chùm quả 5 cây/ô - Tổng số quả thương phẩm, phi thương phẩm/cây
- Số chùm quả/cây (chùm quả): đếm số chùm quả 5 cây/ô - Khối lượng quả (g): cân 10 quả lấy đại diện / ô
- Tỉ lệ đậu quả (%) = (số quả đậu/số hoa) x 100.
Theo dõi trên 3 chùm hoa đầu của cây (từ dưới lên), tính tỉ lệ đậu quả trên từng chùm và tỷ lệ đậu quả trung bình.
- Năng suất cá thể: Số quả/cây x khối lượng trung bình quả (kg/cây) - Năng suất lý thuyết (tấn/ha) = Số quả trung bình/cây x Khối lượng trung bình quả x mật độ trồng/ha
Tổng khối lượng quả thu hoạch (kg/ô)
- Năng suất thực thu = x 1000 Tổng diện tích ô (m2)
* Một số chỉ tiêu về hình thái quả và độ chắc quả
- Dạng quả: được tính theo công thức tính chỉ số hình dạng: I = H/D Trong đó, H: chiều cao quả
D: đường kính quả
Theo tiêu chuẩn ngành 10TCN 219: 2006 của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn chia thành:
Nếu I < 0,6 dạng quả dẹt
Nếu 0,6 ≤ I < 0,9 dạng quả tròn dẹt Nếu 0,9 ≤ I ≤ 1,1 dạng quả tròn Nếu 1,1 < I ≤ 1,3 dạng quả tròn dài Nếu I > 1,3 dạng quả tròn dài - Màu sắc quả khi chín hoàn toàn
- Độ dày thịt quả (mm): Đo bằng thước panme
- Số ngăn hạt/quả: cắt ngang quả và đếm số ngăn hạt/quả.
- Hàm lượng chất khô hòa tan (°Brix): đo bằng khúc xạ kế cầm tay. - Hàm lượng vitamin C (mg/100g): phương pháp sắc ký lỏng cao áp - Hàm lượng đường tổng số (%): phương pháp chuẩn độ oxy hóa khử với ferrycyanure
- Xác định độ chua (%): phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH 0,1N
* Mức độ nhiễm sâu, bệnh trên đồng ruộng
Đối tượng gây hại:
+ Sâu hại: Sâu xanh, sâu đục quả, sâu khoang, sâu vẽ bùa + Bệnh hại: Bệnh sương mai, bệnh đốm nâu.
Đánh giá theo thang điểm từ 0-5 của Trung tâm Rau thế giới - Bệnh sương mai, bệnh đốm nâu được đánh giá:
Điểm 0: Không bị bệnh; Điểm 1: < 10% diện tích bị bệnh; Điểm 2: 10- 24% diện tích bị bệnh; Điểm 3: 25- 49% diện tích bị bệnh; Điểm 4: 50- 74 % diện tích bị bệnh; Điểm 5: >75% diện tích bị bệnh;
3.4.3. Đánh giá khả năng chịu nóng của dòng, giống cà chua
Các giống cà chua được trồng trong vụ Xuân hè muộn gieo hạt ngày 6/3/2018 là vụ có điều kiện nhiệt độ cao, sau đó tiến hành đánh giá khả năng chịu nóng thông qua 2 chỉ tiêu:
- Tỉ lệ đậu quả: tiến hành đánh giá tỉ lệ đậu quả trên 3 chùm hoa đầu tiên, theo dõi tổng số hoa và tổng số quả hình thành trên 3 chùm hoa đầu tiên
- Độ hữu dục của hạt phấn: tiến hành nhuộm hạt phấn được thu từ những hoa mới chớm nở bằng dung dịch KI 1% và đếm tỉ lệ hạt phấn trên hiển vi trường. Mỗi giống tiến hành đánh giá 3 cây, mỗi cây 3 hoa mới nở. Hạt phấn bất dục là hạt phấn không bắt màu hoặc bắt màu nhạt, bị méo mó.
3.4.4. Xác định gen kháng virus xoăn vàng lá Ty-1, Ty-2, Ty-3, Ty-4 bằng chỉ thị phân tử chỉ thị phân tử
a/. Tách chiết DNA:
DNA tổng số được tách từ lá cà chua theo CTAB cụ thể như sau:
- Thu 1g lá non của mỗi dòng giống , nghiền mẫu lá bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng.
- Chuyển bột lá đã nghiền sang ống eppendorf loại 2 ml, bổ sung 800 µl đệm chiết (100 mM Tris - HCl (pH 8), 1.5 M NaCl, 50 mM EDTA (pH 8), 4% (w/v) CTAB và bổ xung 2 % β-mercaptoethanol ngay trước khi dùng), trộn đều hỗn hợp rồi ủ ở 650 C trong 1 giờ, cứ 10 phút lắc nhẹ 1 lần.
- Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thêm 800 µl hỗn hợp chloroform-isoamyl alcohol (24:1) và lắc nhẹ.
- Ly tâm tốc độ 13.000 rpm trong 15 phút, chuyển lớp dung dịch trên sang ống eppendorf 1.5 ml mới.
- Lặp lại bước 3 và 4.
- Thêm 800 µl isopropanol để kết tủa DNA, trộn hỗn hợp bằng cách lắc nhẹ và ủ 30 phút ở -20 0C.
- Ly tâm tốc độ 13 000 vòng trong 15 phút. Đổ dung dịch lỏng đi, rửa DNA ba lần bằng 500 µl dung dịch ethanol 70%.
- DNA được làm khô, sau đó hòa tan trong đệm TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8).
b/. Xác định các gen kháng virus xoăn vàng lá sử dụng cặp mồi của các chỉ thị theo các công bố sau:
Bảng 3.2. Các cặp mồi của gen kháng Ty-1, Ty-2, Ty-3 và Ty-4
TT Trình tự mồi Gen liên
kết Nhiễm sắc thể 1 TG97F TAA TCC GTC GTT ACC TCT CCT T Ty-1 NST số 6 (Han et al., 2012)
TG97R CGG ATG ACT TCA AAT GCA ATG
A
TT Trình tự mồi Gen liên kết
Nhiễm sắc thể
TY2R TGA T(T/G)T GAT GTT CTC (T/A)TC TCT (C/A)GC
al., 2000)
3
P6-25-F2 GGT AGT GGA AAT GAT GCT GAT C
Ty-3
NST số 3 (Ji và cs., 2009) P6-25-R5 GCT CTG CCT ATT GTC CCA TAT
ATA
4
C2-At4g17300F ATT TAA CCG TGT CTG GGC AAC
TCA ATG G Ty-4 NST số 3 (Ji
và cs., 2009) C2-At4g17300R GCT CAC TTT GCA AAT CAC ATC
CCC ATT TCA CC
c. Thành phần phản ứng PCR
Xác định các gen kháng virus xoăn vàng lá bằng phản ứng PCR: dung tích phản ứng 20µl gồm: 10µl PCR master mix, 1.0 µl mồi xuôi (10 µM), 1.0 µl mồi ngược (10 µM), 7 µl nước cho PCR và 1.0 µl ADN khuôn mẫu.
d. Chu kỳ nhiệt
- Biến tính ban đầu ở 940C/4 phút, 35 chu kỳ gồm 940C/30 giây, 530C/1 phút, 720C/1 phút. Kết thúc phản ứng bằng bước kéo dài ở 720C/10 phút và giữ ở -40C
- Riêng gen Ty- 1, 10µl sản phẩm PCR được ủ qua đêm ở 650C với 5 đơn vị enzym TaqI trong 10ul đệm Tango 2X được cung cấp bởi hãng Fermentas để phân biệt alen kháng và mẫn cảm.
e/. Điện di phát hiện sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% với hiệu điện thế 5V/cm, sau đó được muộn màu bằng ethidiumbromide phát quang và chụp ảnh trong buồng UV.
3.4.5. Đánh giá khả năng kháng bệnh xoăn vàng lá bằng lây nhiễm nhân tạo
Sử dụng cả genome của chủng virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua nhân dòng trong vectơ VB65 sau đó biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterial tumefaciens, ký hiệu là AT-VB65
Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được nuôi cấy trên môi trường LB bổ sung kháng sinh Kanamycin (50μl/ml), Rifampicin (35μl/ml) và Streptomycin (100μl/ml). Thành phần môi trường LB gồm: NaCl 10g, Peptone 10g, Cao nấm men 5g, nước cất, pH 7. Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 – 20 phút. Bổ sung kháng sinh trước khi cấy khuẩn.
Phương pháp lây nhiễm:
- Sử dụng kỹ thuật tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mặt dưới của lá (Kheyr-Pour et al., 1991; Navot et al., 1991).
- Mỗi mẫu giống tiêm từ 5-6 cây (cây lớn khoảng 5-6 lá thật )
- Ly tâm dịch vi khuẩn trong điều kiện 5000 rpm/10 phút/20°C (không cần chỉnh PH) và OD ≈ 1. Hòa dịch vi khuẩn trong 10 ml dung dịch chứa MgCl2
10mM và Acetylsyringgone 150μM.
- Để đảm bảo cây không bị lây nhiễm bọ phấn, thí nghiệm được thực hiện tại nhà lưới trung tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen Cây trồng.
- Dùng đầu kim tạo vết thương nhỏ ở mặt dưới lá (không làm thủng lá), sau đó bơm dịch vi khuẩn vào chỗ vết thương.
- Ghi nhãn, đánh dấu lá cây lây nhiễm.
- Sau tiêm 15 ngày thì đánh giá khả năng nhiễm bệnh sau tiêm 40 ngày tiến hành đánh giá mức độ nặng nhẹ của từng cây theo thang điểm DSI từ 0 - 4 (Lapidot và Friedmann, 2002):
0 - Không có triệu chứng bệnh
1 - Vàng rất nhẹ ở mép lá chét trên lá ngọn 2 - Biến vàng nhẹ và đỉnh lá chét cuốn nhẹ
3 - Nhiều lá biến vàng, xoăn và cong lên, cây tiếp tục phát triển
4 - Cây còi cọc, biến vàng nghiêm trọng, lá cong rõ ràng, cây ngừng phát triển.
3.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học thích hợp. Sử dụng phần mềm IRRISTAT 5.0 phân tích ANOVA
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC, NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG CÀ CHUA VỤ THU ĐÔNG 2017 VÀ XUÂN HÈ 2018 CHUA VỤ THU ĐÔNG 2017 VÀ XUÂN HÈ 2018
4.1.1. Các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cà chua thí nghiệm
Chu kỳ sống của cây cà chua được chia ra làm các giai đoạn: phát triển thân lá, hình thành hoa, đậu quả và chín. Thời gian sinh trưởng và phát triển của cây là giai đoạn quan trọng đánh dấu những bước chuyển hóa trong quá trình sinh trưởng của cây. Ngoài yếu tố về giống thì nhiệt độ cũng là một trong những yếu tố quan trọng quyết định đến thời gian sinh trưởng và phát triển của cây. Để có những biện pháp kỹ thuật có lợi cho sự phát triển của cây, xác định được thời vụ trồng hợp lý thì việc nghiên cứu các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây là cơ sở quan trọng nhất.
Kết quả theo dõi các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của các dòng, giống cà chua vụ Thu đông năm 2017 và Xuân hè 2018 được trình bày ở bảng 4.1
- Giai đoạn vườn ươm: Hạt được gieo ngày 5/10, nhiệt độ 27- 290C rất thuận lợi cho quá trình nảy mầm của hạt. Tất cả các dòng, giống cà chua thí nghiệm đều nảy mầm với tỉ lệ cao. Theo tác giả Tạ Thu Cúc, 2006 hạt cà chua có thể nảy mầm ở nhiệt độ 15- 180C, nếu nhiệt độ đạt 25- 300C thì hạt sẽ nảy mầm nhanh hơn. Các dòng, giống cà chua nghiên cứu vụ Thu đông có thời gian từ gieo đến mọc là 3- 4 ngày. Thời gian từ gieo đến trồng là 25 ngày. Vụ Xuân hè 2018 thí nghiệm được tiến hành trong nhà lưới có mái che. Điều kiện thời tiết thuận lợi các dòng, giống cà chua đều nảy mầm sau 3- 4 ngày và ra lá thật 6-7 ngày. Sau khi gieo được 20 ngày các dòng, giống cà chua có 2- 3 lá thật, cây cứng, mập, không bị sâu bệnh đủ điều kiện đem ra trồng ngoài đồng ruộng. Ở vụ Xuân hè giai đoạn đầu thời tiết thuận lợi cho cây cà chua phát triển do đó thời gian từ gieo