Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4.5.Đánh giá khả năng kháng bệnh xoăn vàng lá bằng lây nhiễm nhân tạo
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.5.Đánh giá khả năng kháng bệnh xoăn vàng lá bằng lây nhiễm nhân tạo
Sử dụng cả genome của chủng virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua nhân dòng trong vectơ VB65 sau đó biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterial tumefaciens, ký hiệu là AT-VB65
Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được nuôi cấy trên môi trường LB bổ sung kháng sinh Kanamycin (50μl/ml), Rifampicin (35μl/ml) và Streptomycin (100μl/ml). Thành phần môi trường LB gồm: NaCl 10g, Peptone 10g, Cao nấm men 5g, nước cất, pH 7. Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 – 20 phút. Bổ sung kháng sinh trước khi cấy khuẩn.
Phương pháp lây nhiễm:
- Sử dụng kỹ thuật tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mặt dưới của lá (Kheyr-Pour et al., 1991; Navot et al., 1991).
- Mỗi mẫu giống tiêm từ 5-6 cây (cây lớn khoảng 5-6 lá thật )
- Ly tâm dịch vi khuẩn trong điều kiện 5000 rpm/10 phút/20°C (không cần chỉnh PH) và OD ≈ 1. Hòa dịch vi khuẩn trong 10 ml dung dịch chứa MgCl2
10mM và Acetylsyringgone 150μM.
- Để đảm bảo cây không bị lây nhiễm bọ phấn, thí nghiệm được thực hiện tại nhà lưới trung tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen Cây trồng.
- Dùng đầu kim tạo vết thương nhỏ ở mặt dưới lá (không làm thủng lá), sau đó bơm dịch vi khuẩn vào chỗ vết thương.
- Ghi nhãn, đánh dấu lá cây lây nhiễm.
- Sau tiêm 15 ngày thì đánh giá khả năng nhiễm bệnh sau tiêm 40 ngày tiến hành đánh giá mức độ nặng nhẹ của từng cây theo thang điểm DSI từ 0 - 4 (Lapidot và Friedmann, 2002):
0 - Không có triệu chứng bệnh
1 - Vàng rất nhẹ ở mép lá chét trên lá ngọn 2 - Biến vàng nhẹ và đỉnh lá chét cuốn nhẹ
3 - Nhiều lá biến vàng, xoăn và cong lên, cây tiếp tục phát triển
4 - Cây còi cọc, biến vàng nghiêm trọng, lá cong rõ ràng, cây ngừng phát triển.