5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Nhóm phƣơng pháp hoá sinh
2.3.1.1. Định lượng protein
Xác định hàm lƣợng protein đƣợc thực hiện theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [15]. Mẫu đã nghiền nhỏ đƣợc sấy khô đến khối lƣợng không đổi, sau đó cân 0,05g cho vào ống eppendorf, mỗi mẫu lặp lại 3 lần. Cho vào mỗi ống 1,5ml dung dịch đệm photphat citrat (pH=10 ), đảo đều bằng máy voltex, để trong tủ lạnh 4oC qua đêm, đem ly tâm thu dịch ở 12000 vòng/phút trong 20 phút rồi thu lấy dịch. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
là albumin huyết thanh bò. Dịch chiết đƣợc định mức lên 5 ml và đo hấp thụ quang phổ trên máy quang phổ UV ở bƣớc sóng 750 nm với thuốc thử Folin. Hàm lƣợng protein tan đƣợc xác định bằng % khối lƣợng khô.
Hàm lƣợng protein đƣợc tính theo công thức :
% 100 % m HSPL A protein
Trong đó : A : nồng độ thu đƣợc khi đo trên máy (mg /ml ) HSPL: hệ số pha loãng
m: khối lƣợng mẫu (mg)
2.3.1.2. Định lượng lipit tổng số
Lipit tổng số đƣợc chiết bằng ete dầu hoả (petroleum ether). Hàm lƣợng lipit đƣợc tính bằng hiệu số của khối lƣợng mẫu trƣớc và sau khi chiết và đƣợc tính bằng % khối lƣợng khô. Hàm lƣợng lipit đƣợc tính theo công thức :
% 100 % A B A Lipit
Trong đó: A- khối lƣợng mẫu trƣớc khi chiết (mg)
B- khối lƣợng mẫu sau khi chiết bằng ete dầu hoả (mg)
2.3.1.3. Xác định hàm lượng đường
Xác định hàm lƣợng đƣờng đƣợc thực hiện theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [15]. Hạt các giống ngô đƣợc ngâm trong nƣớc 1giờ, sau đó đƣợc ủ ẩm bằng dung dịch MS pha loãng 10 lần chứa sorbitol 5%. Hạt nảy mầm sau các thời gian ủ 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày đƣợc lấy để xác định hoạt độ của amylase, protease và hàm lƣợng đƣờng. Đối chứng là hạt ngô đƣợc ủ bằng nƣớc không chứa sorbitol.
Hạt nảy mầm đƣợc bóc vỏ lụa, cân 0,05g mẫu và nghiền nhỏ. Cho mẫu vào eppendorf và bổ sung 1,5ml nƣớc cất, li tâm 12000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút, dịch thu đƣợc sử dụng làm thí nghiệm.Thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần. Xác
định hàm lƣợng đƣờng giai đoạn nảy mầm theo phƣơng pháp vi phân tích và đo trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 590nm. Kết quả đƣợc tính theo công thức:
% 100 m HSPL b a X Trong đó X : hàm lƣợng đƣờng tan (%)
a : nồng độ thu đƣợc khi đo trên máy (mg/ml) b : Số ml dịch chiết
HSPL : hệ số pha loãng m : khối lƣợng mẫu (mg)
2.3.1.4. Xác định hoạt độ - amylase
Xác định hoạt độ của - amylase theo phƣơng pháp Heikel đƣợc mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và Trần Thị Áng (1997) dựa vào tính chất hòa tan của - amylase trong dung dịch đệm photphat 0,2M (pH 6,8) [2]. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên ống thí nghiệm, ống kiểm tra, và đo trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 560 nm. Công thức tính: m HSPL ) ( K t A
A: Hoạt độ enzyme (ĐVHĐ/mg hạt nảy mầm) K: lƣợng tinh bột còn lại của mẫu kiểm tra HSPL: hệ số pha loãng
t: lƣợng tinh bột còn lại của mẫu thí nghiệm m: số mg mẫu phân tích
2.3.1.5. Xác định hoạt độ protease
Xác định hoạt độ protease theo phƣơng pháp Ason cải tiến (Nguyễn Văn Mùi, 2001) [15]. Hạt nảy mầm đƣợc bóc vỏ lụa, cân 0,05g mẫu và nghiền nhỏ. Cho mẫu vào eppendorf và bổ sung 1,5ml đệm phosphat pH 6,5, li tâm 12000 vòng/phút ở 4o
nghiệm đƣợc lặp lại ba lần trên ống thí nghiệm, ống kiểm tra, và đo trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 750nm. Hoạt độ protease đƣợc tính dựa trên đƣờng chuẩn xây dựng bằng tyrosin, và đƣợc tính theo công thức:
m T HSPL D k) - (n ÐVHÐ/mg Trong đó:
n: số đo trên máy ống thí nghiệm (mg/ml) HSPL: hệ số pha loãng k: số đo trên máy ống kiểm tra (mg/ml) m: khối lƣợng mẫu (mg)
T: thời gian ủ enzyme với cơ chất D: số ml dịch chiết
2.3.1.6. Phương pháp chiết tách anthocyanin
Quy trình tách chiết anthocyanin từ cây ngô non bị xử lý bởi hạn đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau [4], [101]:
(1) Nguyên liệu tƣơi thu thập về đƣợc lau sạch, mỗi mẫu thí nghiệm cân lấy 5g (mỗi loại nguyên liệu lấy 3 mẫu).
(2) Nghiền nhỏ mẫu thành bột mịn trong nitơ lỏng, bổ sung 20ml dung môi acetone tuyệt đối có 0,01% HCl, để mẫu ở 4oC trong 24 giờ.
(3) Lọc chân không thu lấy dịch (đƣợc lặp lại 3 lần), sau đó bổ sung chloroform (theo tỉ lệ 1:1). Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, sau ly tâm thu dịch màu phía trên.
(4) Dịch chiết đƣợc đo phổ hấp thụ và mật độ quang trên máy quang phổ.
2.3.1.7. Phương pháp định lượng anthocyanin
Định lƣợng anthocyanin theo phƣơng pháp pH vi sai của Luis (2001) [101], dựa trên nguyên tắc: chất màu anthocyanin thay đổi theo pH. Tại dung môi pH 1,0 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, ở dung môi pH 4,5 chúng ở dạng carbinol không màu.
Bƣớc 1: Pha dung môi 0,025M potassium chloride (dung dịch đệm pH 1,0), và 0,4M sodium acetate (dung dịch đệm pH 4,5).
Bƣớc 2: Với mỗi mẫu nghiên cứu chuẩn bị 2 ống corning 15ml, mỗi ống chứa 2ml của một trong hai dung dịch đệm trên. Bổ sung 0,5ml dịch chiết anthocyanin cùng loại vào mỗi ống dung dịch đệm, lắc nhẹ và để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Bƣớc 3: Bật máy quang phổ đo mật độ quang của mẫu trong dung môi pH 1,0 và dung môi pH 4,5 ở bƣớc sóng cực đại 512nm và 700nm.
Giá trị hấp thụ của mẫu (mật độ quang) đƣợc tính theo công thức: A = (Amax.pH 1,0 – A700nm.pH 1,0) - (Amax.pH 4,5 – A700nm.pH 4,5)
Trong đó: Amax, A700nm là độ hấp thụ tại bƣớc sóng cực đại và 700nm, ở pH 1,0 và pH 4,5.
Xác định lƣợng anthocyanin theo công thức (mg/l):
l V HSPL M A a
Trong đó: A- Giá trị hấp thụ của mẫu
M- Khối lƣợng phân tử (449,2); = 26900 HSPL: Hệ số pha loãng
l: chiều dày cuvet (1cm)
Từ đó tính đƣợc hàm lƣợng anthocyanin toàn phần: % 100 10 ) 100 ( % 2 w m a n anthocyani
Trong đó: a: Lƣợng anthocyanin tính đƣợc theo công thức trên; m: Khối lƣợng nguyên liệu ban đầu (g); w: Độ ẩm nguyên liệu (%.).
2.3.2. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống ngô địa phƣơng
Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống ngô địa phƣơng ở giai đoạn cây non theo phƣơng pháp của Lê Trần Bình và Lê Thị Muội (1998) [1].
Hạt ngô nảy mầm đƣợc gieo vào các chậu chứa cát và đất mùn có phân NPK (tỉ lệ 1:1), mỗi chậu trồng 30 cây, 3 chậu cho mỗi giống. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Thời gian đầu cây đƣợc tƣới đủ nƣớc, khi cây ngô đƣợc 3 lá tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả năng chịu hạn của các giống bằng cách xác định tỷ lệ thiệt hại và chỉ số chịu hạn tƣơng đối.
Xác định tỷ lệ cây sống sót (%): Xác định khả năng giữ nƣớc (%): 100% Wfc Wft W
Trong đó: W (%): Khả năng giữ nƣớc của cây sau khi xử lý bởi hạn Wft(g): Khối lƣợng tƣơi của cây sau khi xử lý bởi hạn Wfc(g): Khối lƣợng tƣơi của cây không xử lý
Tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra:
% 100 ) ( c N b N a o
Trong đó: a: Tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra; b: trị số thiệt hại ở mỗi cấp; c: trị số thiệt hại của cấp cao nhất; N0: số cây của mỗi cấp thiệt hại; N: tổng số cây xử lý. Các trị số: Số cây chết: trị số 3; số cây héo: trị số 1; số cây không bị ảnh hƣởng: trị số 0.
Chỉ số chịu hạn tƣơng đối đƣợc tính theo công thức:
) ( sin 2 1 ka jk ij hi gh fg ef de cd bc ab Sn
Trong đó: Sn: chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống ngô; : góc tạo bởi 2 trục mang trị số gần nhau và tính bằng 360/x; a: % số CKH sau 1 ngày
Số cây sống
Tỷ lệ cây sống sót = x 100% Tổng số cây xử lý
hạn; b: % HP sau hạn 1 ngày; c: % CKH sau hạn 3 ngày; d: % CHP sau hạn 3 ngày; e: % CKH sau hạn 5 ngày: f: % CHP sau hạn 5 ngày; g: % CHP sau hạn 7 ngày; h: % CHP sau hạn 9 ngày; i: % CHP sau hạn 11 ngày; j: KNGN sau hạn 1 ngày (%); x: số chỉ tiêu theo dõi.
2.3.3. Nhóm phƣơng pháp sinh học phân tử
2.3.3.1.Phương pháp tách chiết RNA tổng số theo kit Trizol (Invitrogen)
Các bƣớc thực hiện:
(1) Nghiền mịn mẫu thân mầm và bẹ lá ngô bị xử lý hạn qua các ngƣỡng trong nitơ lỏng, lấy 300mg bột mẫu vào eppendorf 2ml đã khử DEPC.
(2) Bổ sung 1ml Trizol, trộn đều mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút.
(3) Bổ sung 1ml hỗn hợp chloroform: isoamin (24:1), lắc mạnh trong 15 giây, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.
(4) Li tâm 13000vòng/phút trong 10 phút, hút 600l dịch phía trên chuyển sang eppendorf 1,5ml đã khử DEPC.
(5) Bổ sung 500l isopropanol, lắc nhẹ, đặt mẫu trong tủ -20oC trong 30 phút để tủa RNA. Li tâm 13000vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn.
(6) Bổ sung 500l cồn 70o để rửa. Li tâm 13000vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn (bƣớc này thực hiện 2 lần).
(7) Làm khô mẫu trong box bật quạt 5 phút, hòa tan cặn bằng 50l nƣớc khử ion có DEPC và DNase, bảo quản mẫu ở -86oC.
2.3.3.2.Phương pháp RT- PCR
Thiết kế và tổng hợp mồi bằng phần mềm DNAstar trên cơ sở các trình tự gen của ngô đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế: gen b1 với mã số NM- 001112236, gen Lc với mã số NM- 001111869, gen tham chiếu Actin (hay housekeeping gene) với mã số NM- 001155179. Các cặp mồi sử dụng để phân lập đoạn gen Lc và B đƣợc tổng hợp tại hãng Invitrogen có trình tự:
LcR1: 5‟- GCTGCCCCTTCACCGCTTCC- 3‟ BF1: 5‟- AGCCGCGAGGAGCATCAACTG- 3‟ BR1: 5‟-TAGCGGCTGCACGTCCATTTCCTC- 3‟ ActF: 5‟- AAGTACCCGATTGAGCATGG - 3‟ ActR: 5‟- TCATAGATTGGAACCGTGTGG - 3‟
Phản ứng RT- PCR đƣợc thực hiện qua hai giai đoạn
(1) Giai đoạn RT: Đây là giai đoạn tổng hợp cDNA từ mRNA. Phản ứng đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của hãng sản xuất Fermentas.
Bƣớc 1: Trộn hỗn hợp gồm 3l RNA, 1l mồi Oligo(dT)18, 8l nƣớc khử ion khử DEPC, li tâm nhanh mẫu, ủ ở 65oC trong 5 phút.
Bƣớc 2: Bổ sung 2l dung dịch đệm cho enzyme phiên mã ngƣợc , 1l dNTPs, 1l Inhibitor, li tâm nhanh mẫu, đặt mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Bƣớc 3: Bổ sung 1l reverse transcriptase. Sau đó đặt mẫu vào máy PCR với
chu trình nhiệt 42o
C trong 1 giờ và 70oC trong 10 phút.
(2) Giai đoạn PCR: cDNA đƣợc sử dụng làm khuôn để khuếch đại đoạn gen B
và Lc. Thành phần của phản ứng đƣợc trình bày trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ Thể tích (l) Nƣớc cất tiêm - 12,5 Dung dịch đệm 10 X 2,5 dNTPs 2,5 mM 2,5 Primer ( F+ R) 10 pmol/l 2,4 cDNA/DNA 100 ng/l 2 MgCl2 25 mM 2,5
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đoạn gen Lc là 94˚C: 3 phút 30 giây; (94˚C: 30 giây; 60˚C: 50 giây; 72˚C: 1 phút 20 giây) lặp lại 30 chu kỳ; 72˚C: 10 phút ; 4˚C: ∞.
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đoạn gen B và Act là 94˚C: 3 phút 30 giây; (94˚C: 30 giây; 58˚C: 50 giây; 72˚C: 1 phút 20 giây) lặp lại 30 chu kỳ; 72oC: 10 phút; 4˚C: ∞.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Sau đó, nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide, soi gel và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.3.3.3.Tạo vector tái tổ hợp
Sản phẩm PCR của các mẫu đƣợc làm sạch theo bộ Kit của hãng Fermentas. Sản phẩm tinh sạch đƣợc gắn trực tiếp vào vector pBT với sự có mặt của T4 ligase (2 unit/l) ở nhiệt độ 22oC trong 2giờ.
2.3.3.4.Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5Lấy 10l vector tái tổ hợp cho vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Lấy 10l vector tái tổ hợp cho vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Đặt hỗn hợp trong đá 20 phút, sau đó ủ ở 42oC đúng 1 phút 30 giây và ủ trong đá 5 phút. Bổ sung 200 l LB lỏng, nuôi lắc hỗn hợp (200 vòng/phút) ở 37oC trong 1 giờ. Lấy sản phẩm ra cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có kháng sinh carbenicillin (50mg/l), IPTG (0,1 mM) và X-gal (40 mg/l). Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trƣờng LB lỏng qua đêm (có bổ sung carbenicillin).
2.3.3.5.Kiểm tra sản phẩm tách dòng
Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm tách dòng bằng phản ứng clony- PCR với cặp mồi LcF1 và LcR1, BF1 và BR1. Phản ứng clony- PCR đƣợc thực hiện theo quy trình ở mục 2.3.3.2.
2.3.3.6.Tách plasmid
Sau khi kiểm tra sản phẩm tách dòng tiến hành tách plasmid bằng dung dịch sol I, sol II, sol II (Bảng 2.3). Các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Bƣớc 1: Chuyển 2ml dịch nuôi sang ống eppendorf. Ly tâm 6000 v/p ở 4o
C trong 5 phút. Loại bỏ dịch môi trƣờng để thu nhận cặn tế bào.
Bƣớc 2: Làm tan cặn tế bào trong 100l dung dịch Sol I (giữ trong đá),
Bƣớc 3: Bổ sung 200l dung dịch Sol II vào mỗi eppendorf. Đậy nắp chặt, đảo ngƣợc eppendorf vài lần và giữ trên đá trong 1 phút
Bƣớc 4: Bổ sung 150l dung dịch Sol III. Đậy nắp chặt, đảo ngƣợc eppendorf vài lần và giữ trong đá trong 3-5 phút.
Bƣớc 5: Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC và hút chuyển dịch phía trên sang ống mới. Bổ sung hỗn hợp chloroform: isoamin (24:1) theo tỉ lệ 1:1, đảo đều mẫu sau đó để ở nhiệt độ phòng 15 phút.
Bƣớc 6: Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC và hút dịch phía trên chuyển sang ống mới.
Bƣớc 7: Tủa plasmid bằng cách bổ sung 1 lần thể tích isopropanol lạnh và giữ ở -20oC trong 30 phút.
Bƣớc 8: Thu tủa bằng cách ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4o
C. Rửa sạch mẫu bằng cách bổ sung 0,5ml ethanol 70độ. Ly tâm thu tủa 12000v/p
trong 10 phút ở 4o
C (lặp lại 2 lần).
Bƣớc 10: Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 2 phút hoặc để mở nắp trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trong box bật quạt.
Bƣớc 11: Hoà tan tủa plasmid trong 50l H2O khử vô trùng chứa 20g/ml RNase. Mẫu đƣợc lƣu giữ ở -20 oC.
Bƣớc 12: Kiểm tra DNA plasmid bằng điện di trên gel agarose 1,0 %.
Các mẫu plasmid tách từ các dòng tế bào đã chọn lọc đƣợc kiểm tra lần thứ hai bằng enzyme BamHI và dung dịch đệm Tango để xác định sự có mặt của sản phẩm PCR đoạn gen Lc và B gắn vào. Thời gian thực hiện phản ứng cắt kéo dài trong 3 giờ ở 37oC. Sản phẩm phản ứng cắt đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch tách plasmid Dung dịch Hóa chất Nồng độ Thể tích Dung dịch I (Sol I) (khử trùng, giữ 4oC) Tris- HCl, 1M, pH 8,0 25 mM 2,5 ml EDTA, 0,5M, pH 8,0 10 mM 2 ml Glucose 50 mM 0,9 g
Dung dịch II (Sol II)
(Pha mới trƣớc khi sử dụng)
NaOH, 2N 0,2 N 10 ml
SDS, 10% 1% 10 ml
Dung dịch III (Sol III) (giữ 4oC)
CH3COOK, pH 5,5 5,0 M 60 ml
CH3COOH 11,5% 11,5 ml
H2O 28,5 ml
(Tổng thể tích mỗi loại Sol, V= 100 ml)
2.3.3.7.Xác định trình tự gen
Xác định trình tƣ̣ DNA theo phƣơng pháp của Sanger và phân tích trên máy tƣ̣ đô ̣ng ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analizer.
2.3.3.8.Phương pháp real- time PCR
Mức độ phiên mã của gen B và Lc đƣợc xác định bằng phản ứng real- time RT- PCR với chất màu gắn huỳnh quang SYBR Green I của hãng Roche và house- keeping gene Actin. Bƣớc đầu tiên của kỹ thuật này là tổng hợp cDNA từ các mẫu RNA tách đƣợc bằng phản ứng RT (thực hiện theo mục 2.3.3.2). Các cặp mồi sử dụng trong real- time RT- PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự cDNA đã phân lập đƣợc và đƣợc tổng hợp tại hãng Invitrogen có trình tự nhƣ sau:
LcF2: 5‟- CGAAACGATAGCCTACCTCAAG - 3‟ LcR2: 5‟- GCACGTCCTTGTCCGAG - 3‟
BF2: 5‟- GTCCATTTCAAGCACTCAACG - 3‟ BR2: 5‟- GTAGGTCATGCAGATCACGTAG- 3‟
ActF: 5‟- AAGTACCCGATTGAGCATGG - 3‟ ActR: 5‟- TCATAGATTGGAACCGTGTGG - 3‟