5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn
thực vật và cây ngô. Các cơ chế này tập trung theo hai hƣớng cơ bản: hƣớng chống hạn và hƣớng chịu hạn. Theo hƣớng thứ nhất, thực vật có sự biến đổi hình thái cơ thể để hạn chế sự mất nƣớc. Hƣớng thứ hai diễn ra nhiều cơ chế: sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu, sự đóng bớt khí khổng, tăng hàm lƣợng các chất hoà tan, tăng kích thƣớc bộ rễ, tăng tổng hợp các chất chỉ thị (anthocyanin, polyamine)...
Các sắc tố hấp thụ năng lƣợng ánh sáng cần thiết cho quang hợp. Chúng có mặt trong các lục lạp của thực vật hoặc phân tán trong tế bào của sinh vật nhân sơ. Chúng bao gồm: sắc tố lục (chlorophyll), sắc tố vàng (carotenoid), sắc tố của thực vật bậc thấp (phicobilin) và sắc tố dịch bào (anthocyanin). Trên cơ sở số liệu về hàm lƣợng các dạng sắc tố trong lá, ngƣời ta có thể đánh giá khả năng quang hợp của thực vật và xếp thực vật thuộc nhóm ƣa sáng hay ƣa bóng, thực vật C3 hay C4 [67].
Hình 1.1. Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin [3]
Anthocyanin là những glucozit, thuộc họ flavonoid, do gốc đƣờng glucose, glactose... kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin). Aglucon của chúng có cấu trúc cơ bản đƣợc mô tả trong Hình 1.1. Các gốc đƣờng thƣờng đƣợc gắn vào vị trí 3 và 5, ít gắn vào vị trí 7. Phân tử anthocyanin gắn đƣờng vào vị trí 3 gọi là monoglycozit, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycozit. Các aglucon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1 và R2, thƣờng là H, OH hoặc OCH3 [3]. R1 OH OH O+ 3 R2 OH OH A 3 5 7 B
Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh, phụ thuộc nhất vào pH môi trƣờng, sau đó là các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác. Khi pH < 7 các anthocyanin thƣờng có màu đỏ, khi pH> 7 thì có màu xanh. Ở pH 1 các anthocyanin thƣờng ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH 4- 5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không màu, ở pH 7- 8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh [3].
Anthocyanin có bƣớc sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng 510- 540nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin, chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ anthocyanin: thƣờng pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh [67].
Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên đƣợc sử dụng rất an toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý nhƣ khả năng chống oxy hóa cao nên đƣợc sử dụng để chống lão hóa, chống oxy hóa thực phẩm; hạn chế sự suy giảm sức đề kháng; làm bền thành mạch; chống viêm; hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thƣ; tác dụng chống các tia phóng xạ [40], [158]. Anthocyanin làm tăng khả năng giữ nƣớc của tế bào khi bị hạn và gió khô [184].
Anthocyanin đƣợc tìm thấy trong không bào của tế bào biểu bì, mô mạch dẫn. Chúng xuất hiện trong rễ (cả rễ nằm sâu dƣới đất và trên mặt đất), trụ dƣới lá mầm, bao lá mầm, thân (cuống), củ, thân rễ, thân bò, thân hành, lá [36], [145], [78]. Những bộ phận mầu đỏ trong các quần xã đều thể hiện sự đa dạng về màu của anthocyanin. Ở lá, anthocyanin tạo màu cho cả bề mặt lá, mép lá, viền sọc, các vết đốm. Một số lá chuyển màu đỏ trƣớc khi bị cắt, hay khi phát triển và tồn tại suốt thời gian sống. Ở nhiều loài, anthocyanin chỉ đƣợc tổng hợp khi chúng không khoẻ hay phản ứng với điều kiện bất lợi của môi trƣờng [173].
Mặc dù áp lực của chọn lọc tƣ̣ nhiên dẫn đến sự tiến hoá của anthocyanin ở nhiều cấu trúc soma chƣa rõ ràng, các nhà khoa học về sinh lý thực vật đã có những đóng góp ý nghĩa để đƣa ra các kết luận về chức năng của anthocyanin trong 10 năm qua. Chức năng của anthocyanin trong các bộ phận khác nhau của thực vật bao gồm: (1) bảo vệ lục lạp khỏi tác động bất lợi của ánh sáng; (2) hạn chế bức xạ của tia UV-B; (3) hoạt tính chống oxi hoá. Sinh tổng hợp anthocyanin ở lá đƣợc tăng cƣờng để đáp ứng với điều kiện cực đoan của môi trƣờng: ánh sáng mạnh, UV-B, nhiệt độ cao, hạn, ozone, thiếu nitơ và P, nhiễm nấm và vi khuẩn, tổn thƣơng, côn trùng, ô nhiễm [89]. Do vậy, anthocyanin đƣợc coi là một dấu hiệu của điều kiện cực đoan và là một phần trong cơ chế hạn chế tác động bất lợi do điều kiện đó gây ra.
Mặc dù quang hợp cần có ánh sáng nhƣng các lƣợng tử của pha sáng có thể ảnh hƣởng tới các thành phần của hệ thống quang hợp và có thể dẫn đến quá trình sửa chữa hay phá huỷ thứ cấp trên màng thylakoid [25]. Anthocyanin ở lá chủ yếu hấp thụ bƣớc sóng ánh sáng xanh và vàng. Mô giậu của những lá đỏ có thể tiếp nhận ánh sáng màu xanh kém hơn mô giậu ở lá màu xanh, và lá màu đỏ có thể phát triển đặc điểm hình thái và sinh lý của lá cây ƣa bóng [108]. Anthocyanin có khả năng lọc ánh sáng để làm giảm mức độ nghiêm trọng do sự ức chế quang hoá (photoinhibition) gây ra và phục hồi quang tổng hợp ở lá [67]. Thực nghiệm cho thấy, anthocyanin bảo vệ quang hoá khi có mặt ở cả lá già và cây rụng lá, cây trƣởng thành, lá già qua đông của cây thƣờng xanh, hay lá non [45], [77], [81].
Khi gặp điều kiện cực đoan của môi trƣờng, tế bào xảy ra sự hấp thụ một lƣợng lƣợng tử và tạo ra hàng loạt các dạng oxy hoạt hóa, hay còn gọi là các gốc tự do (ROS), gây tổn thƣơng, thậm chí làm chết tế bào. Những yếu tố môi trƣờng gây ra stress ôxy hóa có thể kể đến là: ô nhiễm môi trƣờng do nồng độ ozone hoặc SO2 quá cao, do chất diệt cỏ bị ôxy hóa, kim loại nặng, hạn, nóng,
lạnh, tổn thƣơng cơ học, UV, điều kiện chiếu sáng cao liên tục. ROS tồn tại trong tự nhiên và cơ thể sống có thể kể đến là: oxy phân tử (O2), singlet oxy, superoxide anion (O2-), hydrogen peroxide (OH*), pehydroxyl radical (O2H*), ozon. Phần lớn chúng tạo ra trong chu trình chuyển hóa electron trong ty thể hoặc lục lạp. Tuy nhiên, những hợp chất oxy hoạt hóa nhƣ superoxide anion (O2- ) hay H2O2 cần cho sự hóa gỗ (sự lignin hóa) và thực hiện chức năng nhƣ tín hiệu phản ứng bảo vệ đối với hiện tƣợng nhiễm bệnh. Lignin đƣợc hình thành từ coniferyl alcohol, dƣới tác động của các ROS tạo thành các gốc tự do của coniferyl alcohol. Các gốc tự do này tiếp theo tạo thành dimer và polymer lignin. Hệ thống bảo vệ cây trồng nhằm loại bỏ các hợp chất này đƣợc thực hiện nhờ các chất chống oxy hóa có ở một số bào quan [89]. Các chất này bao gồm các enzyme và hợp chất khác không phải enzyme. những hợp chất này không có mặt ở tất cả mọi nơi, mà phụ thuộc vào các hệ thống khác nhau giữa các loài khác nhau, chúng có thể biểu hiện ở những bào quan nhất định. Những hợp chất chống oxy hoá chính là ascorbate (vitamin C), reduce glutathione (GSH), vitamin E và carotenoid (các chất này gọi còn gọi là LMWA, low molecular weight antioxidants). Ngoài ra polyamine và flavonoid cũng chống lại sự tổn thƣơng do oxy hoá của những gốc tự do [89], [144].
Trong tế bào thực vật, ty thể và lạp thể là hai nguồn tạo ra ROS thông qua các phản ứng của quang hợp và hô hấp. Nguồn enzyme của ROS gồm NADPH oxidase trên màng, oxilate oxidase và amine oxidase trong apoplasm, peroxidase trên thành tế bào [65], [87]. Các tác nhân bất lợi của môi trƣờng có thể làm tăng hàm lƣợng ROS gấp 3 lần so với bình thƣờng [137]. Anthocyanin là loại sắc tố phổ biến có khả năng chuyển hoá ROS gấp 4 lần so với vitamin E, C. Hiệu quả này bắt nguồn từ độ phản ứng cao nhƣ là chất cho proton và điện tử. Nghiên cứu
In vitro cho thấy các flavonoid làm vô hiệu hoá hầu hết các ROS và các gốc nitơ quan trọng. Thí nghiệm in vivo đã thuyết phục đƣợc chức năng loại bỏ ROS của
flavonoid [174]. Agati và cộng sự (2007) tiến hành ngâm lá Phillyrea latifolia
trong DanePy, fluorochrome. Kết quả kiểm tra lát cắt ngang của lá dƣới kính hiển vi khẳng định rằng O2- đã bị loại bỏ khi chiếu ánh sáng với cƣờng độ mạnh, và chức năng này chủ yếu là do sự có mặt của flavonoid ở lục lạp và tế bào thịt lá [26]. Hoạt tính chống oxi hoá có thể giải thích bằng sự có mặt của anthocyanin hay không? Có hai cơ chế anthocyanin có thể làm giảm oxi hoá ở lá. Cơ chế thứ nhất, anthocyanin có thể hạn chế hay điều hoà phản ứng pha sáng, pha tạo ra ROS, bằng cách làm giảm một lƣợng các lƣợng tử cao năng liên quan đến các tế bào tham gia quang hợp [81], [114], [123]. Neill SO và Gould (2003) cho rằng lục lạp không thực hiện đƣợc chức năng trong dung dịch có lƣợng nhỏ gốc O2
-, và ít bị tẩy màu khi chiếu sáng ánh sáng đơn sắc đỏ so với ánh sáng trắng [124]. Thứ hai, anthocyanin có thể loại ROS trực tiếp. Anthocyanin thƣờng không màu hay xanh da trời ở pH tế bào chất, chúng chuyến sang đỏ khi đƣợc chuyển vào không bào qua nang vận chuyển [139]. Các enzyme chuyển hoá ROS (SOD và APX) trong lục lạp là kết quả của sự ức chế quang hợp và quang oxi hoá. Những enzyme này chuyển hoá O2, và H2O2 rất hiệu quả. Tuy nhiên, ánh sáng mạnh kèm theo tress lạnh làm bất hoạt của APX, SOD dẫn đến tăng nồng độ H2O2. Anthocyanin có thể bảo vệ các enzyme chống oxi hoá bằng cách hạn chế lƣợng ánh sáng vào tế bào quang hợp, do đó giảm sự phát sinh ROS [164]. Một thực nghiệm khác cũng cho thấy, khi cây bị chiếu sáng mạnh, lục lạp không thực hiện đƣợc chức năng và sản sinh ra các gốc O2-, gốc này đƣợc dạng không màu và màu đỏ của cyanidin glycosides loại bỏ. Nhƣ vậy, anthocyanin đƣợc cho là có chức năng bảo vệ quang hoá và phục hồi quang tổng hợp ở lá [36], [78]. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, anthocyanin loại cyanindin-3- O -glucose chloride có tác dụng lớn trong việc bảo vệ chống lại sự phân hủy vitamin C, E, beta carotene (Hình 1.2) [158].
Nguồn: www.Sciencedirect.com
Hình 1.2. Vai trò chất chống oxy hóa của anthocyanin
Bên cạnh anthocyanin, nồng độ LMWA đóng vai trò là chất chống oxi hoá có hoạt tính enzyme, và cũng có mặt nhiều trong lá đỏ hơn lá xanh. Đối với cây ngô, cũng giống nhƣ Elatostema rugosum, các dẫn xuất axit caffeic nhiều hơn và hoạt tính SOD và CAT cũng cao hơn ở lá màu đỏ so với lá màu xanh. Trong điều kiện bị nhiễm độc kim loại, lá cây tăng cƣờng tổng hợp anthocyanin với vai trò là những chất có hoạt tính SOD, APX, và glutathione reductase [89].
Các nhà nghiên cứu di truyền học khẳng định rằng, sự có mặt dồi dào ROS là nguyên nhân của sự phá huỷ không giới hạn các thành phần tế bào. Thực tế là ROS xuất hiện sẽ kích thích tế bào thực vật tổng hợp ra các phân tử dấu hiệu liên quan đến sự đóng mở khí khổng, hàng rào ngăn cản mầm bệnh, quá trình
Bào tƣơng
Quá trình oxi hóa
Không bào
chết của tế bào và chống chịu điều kiện cự đoan của môi trƣờng- ngƣời ta gọi đó là “oxidative signalling”. Chức năng quan trọng và quyết định trong các cơ chế cảm ứng của tế bào thực vật với môi trƣờng và điều hoà các quá trình biểu hiện gen, trao đổi chất và sinh lý [89].
Sau cùng, anthocyanin có thể phản ứng với các chất trung gian thứ cấp trong con đƣờng chuyển hoá ROS, ví dụ nhƣ sucrose. Quá trình sinh tổng hợp anthocyanin đƣợc tăng cƣờng mạnh bởi sucrose trong cây củ cải (Raphanus sativus), cây thƣờng xuân nƣớc Anh (Hedera helix), Arabidopsis thaliana. Các loại đƣờng hoà tan, đặc biệt sucrose, glucose, fructose đƣợc biết đến với vai trò trung tâm điều khiển sự phát triển của thực vật, chống chịu mất cân bằng áp suất thẩm thấu và biểu hiện gen. Quá trình tích luỹ đƣờng liên quan đến tính chống chịu với các điều kiện cực đoan nhƣ hạn, muối, ánh sáng cao, lạnh, mầm bệnh. Trong quá trình này, đƣờng có liên quan đến sự điều chỉnh cân bằng chất oxi hoá và chất chống oxi hoá trong tế bào, sucrose vừa tham gia vào quá trình sản sinh ROS và vừa tham gia chuyển hoá chúng [173].