5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.2. Phản ứng của cây ngô trƣớc tác động của hạn
1.2.1. Mối liên quan giữa hạn và tính chống chịu stress oxy hóa
1.2.1.1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa
Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nƣớc do môi trƣờng gây nên làm ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển. Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể làm giảm thiếu hụt mức độ tổn thƣơng do thiếu nƣớc gây ra gọi là tính chịu hạn.
Có hai loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn diện), và hạn sinh lí. Hạn đất là do lƣợng nƣớc trong đất giảm làm hệ rễ của cây không thể lấy nƣớc từ đất vào tế bào dẫn đến cây có hiện tƣợng bị héo lâu dài. Hạn không khí thƣờng có đặc trƣng là nhiệt độ cao (39- 42oC) và độ ẩm thấp <62%. Hạn không khí thƣờng gây nên hiện tƣợng héo tạm thời vì rễ cây không hút đủ nƣớc mà quá trình thoát hơi nƣớc quá nhanh do nhiệt độ môi trƣờng cao. Hạn sinh lí khác với hai loại hạn trên ở chỗ môi trƣờng vẫn đầy đủ nƣớc nhƣng do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trƣờng tế bào và môi trƣờng bên ngoài nên rễ cây không có khả năng hút nƣớc.
Hạn đất tác động mạnh lên bộ rễ của cây. Hiện tƣợng này gây ra các biểu hiện thích ứng tại vùng xảy ra yếu tố cực đoan và ở mức độ cao hơn, biểu hiện thích ứng toàn cơ thể. Hạn có thể tạo ra những hạt khô, nhăn nheo, không có phẩm chất tốt và thậm chí mất mùa hoàn toàn. Ở ngô sự trỗ cờ và phun râu phải xảy ra đồng thời. Hiện tƣợng phun râu ngô chậm gắn liền với sự chịu hạn bởi vì râu ngô chứa phần lớn là nƣớc. Chọn giống theo hƣớng phun râu đồng thời (không bị chậm) là phƣơng pháp hữu hiệu để chọn đƣợc giống chịu hạn ở ngô ở các vùng Mỹ, Canada [10].
Hạn không khí, nhiệt độ thƣờng xảy ra ở những vùng gió nóng, nhiệt độ cao. Hạn không khí tác động chủ yếu lên các bộ phận bên trên mặt đất nhƣ lá, hoa... Phản ứng của cây theo chiều hƣớng giảm cƣờng độ thoát hơi nƣớc và nhƣ vậy sẽ làm tăng nhiệt độ cơ thể. Đồng thời với tăng nhiệt độ không khí, yếu tố nhiệt độ ảnh hƣởng lớn nhất đến quá trình hình thành hạt phấn và thụ phấn của ngô. Cần phải nhấn mạnh rằng trong quá trình phát triển của cây có những giai đoạn bị khủng hoảng: bắt đầu từ lúc hình thành các cơ quan sinh sản, kết thúc vào lúc thụ phấn hoàn toàn. Đây là thời kỳ cây cần nƣớc nhất và kém chịu đựng nhất. Hạn xảy ra trong thời gian này làm giảm năng suất một cách đáng kể.
Nƣớc tồn tại ở dạng liên kết trong tế bào. Màng tế bào là nơi bị tổn thƣơng đầu tiên khi xảy ra mất nƣớc. Thiếu nƣớc nhẹ chỉ làm thay đổi một phần cấu trúc của protein, lipit trên màng tế bào. Lớp lipit cấu trúc chuyển từ trạng thái hoạt hoá tinh thể lỏng sang dạng gel không còn linh hoạt, và kém nhất là chuyển sang trạng thái lục lăng ngƣợc. Trong trạng thái cuối cùng màng lipit kép bị gián đoạn, các phức enzyme bị phá tung, dịch tế bào có thể dò rỉ ra ngoài. Tiếp sau đó các hệ thống màng khác trong tế bào nhƣ màng lƣới nội chất, màng lục lạp, màng ty thể cũng bị thiếu nƣớc và không còn khả năng trao đổi chất [10].
Hiện tƣợng nóng hạn còn tạo ra các gốc tự do của hydroxyl, superoxide... oxy hoá các đại phân tử và làm mất hoạt tính của chúng. Ngoài ra, các sản phẩm
phân hủy của các đại phân tử và nồng độ ion cao khi mất nƣớc gây độc cho tế bào. Khi bắt đầu mất nƣớc sự tổng hợp protein đƣợc tăng cƣờng, nhƣng hạn kéo dài sẽ xảy ra hiện tƣợng thủy phân protein. Stress oxy hóa xảy ra trong điều kiện tạo ra hàng loạt các dạng oxy hoạt hóa (reactive oxygen species - ROS) gây tổn thƣơng, thậm chí làm chết tế bào [115]. Những yếu tố môi trƣờng gây stress oxy hóa có thể kể đến là: nồng độ ôzon hoặc SO2 quá cao, chất diệt cỏ bị ôxy hóa, kim loại nặng, hạn, nóng, lạnh, tổn thƣơng cơ học, UV, chiếu sáng liên tục, sự xâm nhập của mầm bệnh, sự lão hóa... Ở những điều kiện này, thúc đẩy hiện tƣợng ức chế quang hợp [66].
1.2.1.2. Các dạng oxy hoạt hóa (reactive oxygen species - ROS)
ROS tồn tại trong tự nhiên và cơ thể sống có thể kể đến là: oxy phân tử (O2); oxy dạng đơn (singlet oxy), superoxide anion (O2-), hydro peroxide tự do (OH*), hydro peroxide (H2O2), pehydroxyl tự do (O2H*), ozon (O3)... Phần lớn chúng tạo ra trong chu trình chuyển hóa electron trong ty thể hoặc lục lạp. Tuy nhiên, những hợp chất oxy hoạt hóa nhƣ superoxide anion (O2-
), H2O2 cần cho sự hóa gỗ (sự hóa lignin) và thực hiện chức năng nhƣ tín hiệu phản ứng bảo vệ đối với hiện tƣợng nhiễm bệnh [35].
ROS đặc biệt là OH* tác động lên lipit không no làm đứt gãy chuỗi tạo một loạt các sản phẩm nhƣ lipit hydroperoxide mà tiếp sau đó có thể tạo thành các gốc tự do khác dƣới tác động của ion Fe: R*, RO*, ROO*, aldehyde. Những sản phẩm này có thể tƣơng tác tạo thành oxygen gốc tự do [43].
ROS tác động lên protein làm biến đổi những điểm đặc biệt, ngắt đoạn chuỗi peptid, thay đổi điện tích và cuối cùng làm tăng khả năng nhậy cảm đối với các protease [43].
ROS tác động và gây tổn thương lên DNA. Hậu quả có thể là gây đột biến DNA nhƣ mất đoạn hoặc những hiêụ ứng di truyền có hại khác. ROS có thể tác động lên gốc đƣờng hoặc gốc base ở những vị trí mẫm cảm. Tuy nhiên không phải
lúc nào ROS cũng có hại. Ví dụ nhƣ trƣờng hợp cây bị nhiễm bệnh, thụ thể nhận tín hiệu bên ngoài hoạt hóa peroxidase, NAD(P)H oxidase, O2-
và H2O2 đƣợc tạo ra để diệt mầm bệnh, đồng thời kích hoạt hệ thống bảo vệ của tế bào [43].
1.2.1.3. Hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của oxy hóa
Phản ứng của cây trồng còn biểu hiện nhƣ đóng khí khổng để ozon không xâm nhập đƣợc vào mô lá đồng thời hoạt hoá các hệ chống ôxy hoá. Hệ thống bảo vệ cây trồng bao gồm các enzyme và hợp chất không phải enzyme. Những hợp chất đó là:
Superoxide dismutase - SOD: H2O, O2 là những yếu tố cần thiết để duy trì sự sống trong cơ thể. Nhƣng dƣới sự tác động của môi trƣờng bất lợi, trong các hệ thống chuyển năng lƣợng và electron của tế bào thƣờng tạo ra các gốc tự do. Sự có mặt của SOD sẽ xúc tác phản ứng loại bỏ superoxide [115].
Catalasse là enzyme có chứa nhân hem, xúc tác cho phản ứng chuyển hoá H2O2 thành H2O và O2. Tất cả các isozym của enzyme này đều là tetramer có MW= 220000Da. Sự đa dạng của enzyme cũng đƣợc nêu lên trong nhiều loại thực vật khác nhau [115]. Ví dụ: catalase từ ngô có 3 isozym cat-1, cat-2, cat-3. Gen mã hoá cho chúng nằm trên các vị trí khác nhau nhiễm sắc thể và không phụ thuộc vào nhau. Cat-1 và cat-2 có trong peroxisome và dịch tế bào, cat-3 thấy trong ty thể [153].
Các enzyme chuyển hoá ascorbate: ascorbate loại bỏ gốc tự do theo các hƣớng khác nhau. Trong lục lạp, H2O2 chuyển hoá thành H2O dƣới tác dụng của ascorbate peroxidase, ascorbate tạo ra monodehydroascorbate radical. Chất này chuyển hoá về ascorbate nhờ monodehydroascorbate reductase và năng lƣợng của NADP. Bằng cách khác, monodehydroascorbate radical chuyển hoá thành dehydroascorbate, chất này dƣới tác dụng của dehydroascorbate reductase phản ứng với glutathion tạo thành ascorbate và oxidized glutathione (GSSG). GSSG chuyển về dạng GSH nhờ glutathione reductase và năng lƣợng của NADP [115].
Glutathion (GSH) là tripeptid (Glu-Cys-Gly), tính chống oxi hóa nhờ gốc SH của Cys. Một số legume có chứa một dạng đồng dạng khác: Glu-Cys-Ala. GSH thực hiện chức năng bằng nhiều cách: phản ứng thẳng với oxygen, superoxide, hydroxyl radical, loại bỏ các dạng acyl peroxide đƣợc hình thành khi lipit bị oxy hóa bởi peroxide [128].
Glutathion reductase (GR) khử GSSG thành GSH. Đây là enzyme tƣơng đối bảo thủ. Nếu nhƣ ở động vật chỉ có một dạng, thì ở thực vật phát hiện ra nhiều isozym trên điện di hai chiều và có thể là sản phẩm của các gen khác nhau. GR có trong lục lạp, nhƣng hoạt tính cao ở trong dịch tế bào, ở trong ty thể ít hơn [115].
Ngoài các hợp chất có bản chất enzyme trên, các chất khác không có hoạt tính xúc tác sinh học cũng tham gia trực tiếp chuyển hóa các gốc tự do nhƣ: vitamin E, vitamin C, carotenoid, polyamin, zeaxanthin và flavonoid. Chúng tƣơng tác với các gốc carbocyl tự do, hạn chế sự chuyển hóa thành các gốc tự do khác. Carotenoid và flavonoid còn nhận năng lƣợng ánh sáng, hạn chế tác động của ánh sáng và các gốc tự do sinh ra trong quá trình quang hợp.
1.2.2. Cơ sở sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở ngô
1.2.2.1. Cơ sở hình thái, sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn
Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật rất phức tạp liên quan đến các đặc điểm hình thái giải phẫu, sinh lí, hoá sinh, và liên quan đến các gen chịu hạn. Hiện nay có nhiều quan điểm khác nhau giải thích cơ chế chịu hạn, trong đó có hai quan điểm đƣợc chấp nhận hơn cả là vai trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu.
Bộ rễ có hình thái khoẻ, dài, mập, có sức xuyên sâu cho cây hút đƣợc nƣớc ở những vùng sâu, vùng xa [29]. Môi trƣờng hạn gây ra các biểu hiện thích ứng tại vùng xảy ra yếu tố cực đoan và ở mức độ cao hơn sẽ biểu hiện toàn bộ cơ
thể. Trong trƣờng hợp có mặt axit abscisis quá trình đóng mở lỗ khí đƣợc điều chỉnh làm hạn chế sự thoát hơi nƣớc [172].
Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nƣớc của tế bào rễ cây đối với đất. Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu đƣợc các phân tử nƣớc hiếm hoi có trong đất nhờ vậy cây ngô có thể vƣợt qua tình trạng hạn cục bộ [120]. Khi tế bào mất nƣớc, các chất hoà tan sẽ đƣợc tích luỹ nhằm chống lại việc giảm mất nƣớc, tăng khả năng giữ nƣớc của nguyên sinh chất và chúng có thể thay vị trí nƣớc nơi xảy ra các phản ứng sinh hoá, tƣơng tác với lipit hoặc protein trong màng ngăn chặn sự phá huỷ của màng và các phức protein. Các chất hoà tan có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao bao gồm các ion K+, proline, axit hữu cơ, các loại đƣờng. Khi bắt đầu mất nƣớc, hàm lƣợng proline và ABA tăng, tăng tổng hợp protein, nhƣng nếu hạn kéo dài sẽ xảy ra hiện tƣợng thuỷ phân protein [147], [161]. Quá trình thuỷ phân các hydratcacbon dự trữ cũng là nguồn cung cấp chất tan cho quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu [184].
Hạn là yếu tố phổ biến làm giảm năng suất cây trồng nói chung. Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về tính chịu hạn của cây ngô. Tính chịu hạn của cây ngô có liên quan tới sự sinh trƣởng và phát triển của bộ rễ. Trong môi trƣờng bị hạn rễ thƣờng phát triển theo chiều sâu và số lƣợng rễ tăng lên [84]. Việc đánh giá các giống thí nghiệm trong điều kiện khô hạn trên đồng ruộng cho thấy những giống có khối lƣợng rễ lớn thì có khả năng chịu hạn tốt hơn.
Tốc độ vƣơn dài của lá phụ thuộc vào sự thay đổi về thế nƣớc của lá và khả năng cung cấp nƣớc của đất. Đây cũng là một chỉ tiêu để đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô. Ở điều kiện bình thƣờng, cây thực hiện các chức năng sống của mình thông qua các quá trình sinh lí và sinh hoá. Khi gặp điều kiện khô hạn hoặc nhiệt độ cao, các tính chất lí hoá của keo nguyên sinh thay đổi ví dụ nhƣ:
tính đàn hồi và độ nhớt bị giảm, đồng thời trao đổi chất cũng giảm, tế bào bị mất nƣớc. Kết quả tế bào sẽ bị chết do mất tính bán thấm, không có hiện tƣợng co nguyên sinh chất [10]. Đặc điểm này là cơ sở xây dựng các phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng của cây: phân tích protein, axit amin, ABA...
Axit abscicis có vai trò quan trọng đối với khả năng chịu hạn ở ngô. Kết quả nghiên cứu của các tác giả Hu và cộng sự (2012), Jiang và cộng sự (2013) chứng minh vai trò trung tâm trong việc điều khiển sự đóng mở khí khổng duy trì cân bằng nƣớc của cây ngô bị hạn. Sự xuất hiện ABA trong điều kiện hạn có liên quan đến các gen đặc hiệu [80], [85].
Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính rất quan trọng của tế bào khi bị mất nƣớc do lạnh, muối hoặc nóng hạn. Những thực vật tồn tại trên môi trƣờng mất cân bằng về áp suất thẩm thấu đòi hỏi phải có khả năng chống lại đƣợc điều kiện khắc nghiệt đó. Tồn tại 2 cơ chế khắc phục sự bất lợi này: (1) Khả năng thích nghi đặc biệt của cấu trúc và hình thái rễ, lá để tránh cho tế bào khỏi mất nƣớc; (2) Khả năng chịu mất nƣớc dựa trên sự thay đổi tinh vi trong sinh hoá tế bào dẫn đến sự xuất hiện và tích lũy các chất hoà tan, protein, axit amin đặc hiệu.
Proline có vai trò rất quan trọng trong quá trình điều hoà áp suất thẩm thấu trong tế bào, đồng thời nó còn là một axit amin ƣa nƣớc có khả năng giữ và lấy nƣớc cho tế bào, ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+, tƣơng tác với protein màng và lipit màng, ngăn chặn sự phá huỷ của màng và các phức protein khác [106]. Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy khi cây trồng gặp hạn, cây giảm tổng hợp protein và tăng tổng hợp proline. Sự thay đổi về một số axit amin, đặc biệt là proline có liên quan đến tính chịu hạn của ngô. Kết quả nghiên cứu của Yamada và cộng sự (2005) cho thấy hàm lƣợng proline tăng lên ở điều kiện mất nƣớc cực đoan [177].
tƣơng tác với màng tế bào, hình thành cầu nối hydro giữa gốc hydroxyl của sucrose với nhóm phospholipit. Bằng cách này chúng thay thế vị trí nƣớc trong màng tế bào. Sự có mặt của chúng trong nguyên sinh chất còn có khả năng bảo vệ các phức enzyme khác. Chức năng chính của chúng là ngăn chặn sự thay đổi và tăng cƣờng áp suất thẩm thấu, ổn định pH cho tế bào [154].
Fructant là phân tử polyfructose có ở nhiều loại thực vật. Chúng đƣợc tổng hợp từ sucrose và trữ trong các không bào ở dạng hòa tan. Những giống có tích luỹ fructant cao đều có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu khi gặp điều kiện cực đoan nhƣ hạn và lạnh. Đó chính là khả năng chuyển hoá một cách nhanh chóng fructant thành các sản phẩm có độ polimer hoá thấp hơn. Mức độ polimer hoá trung bình của fructant suy yếu dần với sự mất nƣớc và giảm nhiệt độ [63].
1.2.2.2. Cơ sở sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô
Tính chịu nóng hạn của cây trồng đƣợc hình thành trong quá trình tiến hoá tự nhiên, do một hệ đa gen quyết định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây [41]. Kết quả phân tích microarray ở đối tƣợng Arabidopsis
khi sử dụng 1300 cDNA cho thấy có khoảng 44 gen. Ngày nay vẫn chƣa tìm đƣợc gen thực sự quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu hạn [150]. Các gen chịu hạn của những cây hạn sinh lý vẫn là vấn đề nghiên cứu lý thú đối với các nhà khoa học.
Yếu tố ARE (Antioxidant Responsive Element) có trong vùng promoter của các gen glutathion stransferase, Mn- Superoxide dismutase (Mn-SOD). Vai trò của ARE là kích hoạt các gen này biểu hiện thành sản phẩm protein trong điều kiện cực đoan oxy hoá. Những yếu tố này cũng tìm thấy trong vùng promoter của các gen chống oxy hoá ở thực vật (cat của ngô). Vai trò của các yếu tố này là