5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.3.3. Đặc điểm cấu trúc protein thuộc họ bHL Hở cây ngô
Ở ngô, gen R là thành viên đầu tiên của họ bHLH đƣợc phát hiện. Đối với phân tử protein R và Lc hoàn chỉnh ở ngô có 610 axit amin gồm các vùng: (1) vùng MIR có vị trí từ axit amin 1-252 ở đầu N; (2) vùng có tính axit ở vị trí từ axit amin 253-410; (3) vùng xoắn- vòng- xoắn cơ bản hay bHLH có vị trí từ axit amin 411-462; (4) vùng dimer hóa đầu C vị trí từ axit amin 525- 610 [61]. Phân tử protein Lc có ba tín hiệu định vị nhân quan trọng: (1) nằm vùng MIR thuộc đầu N, (2) trong vùng xoắn- vòng- xoắn (bHLH), và (3) trong vùng dimer hóa đầu C (Hình 3.16). Trƣớc đây, ngƣời ta cho rằng, các tín hiệu định vị nhân này không cần thiết. Song kết quả thực nghiệm cho thấy việc loại bỏ tín hiệu thứ hai hay thứ ba dẫn đến kết quả định vị nhân kém hiệu quả [75].
Đối với phân tử protein B hoàn chỉnh có 562 axit amin gồm các vùng: (1) vùng MIR có vị trí từ axit amin 1-252; (2) vùng có tính axit ở vị trí từ axit amin 253-410; (3) vùng xoắn- vòng- xoắn cơ bản hay bHLH có vị trí từ axit amin 411-462; (4) đoạn peptit đầu C vị trí từ axit amin 462-562 [61].
Mỗi một vùng của protein nhóm bHLH có chức năng khác nhau. Vùng MIR là nơi tƣơng tác với protein MYB. Những biến đổi ở vị trí 19 trong vùng này luôn đi kèm với sự thay đổi ở vị trí 16 lizin [178]. Trong nghiên cứu của Pattanaik và cộng sự (2008) trên đối tƣợng cây tía tô (Perilla frutescens), sự thay thế lyzin thành methionin ở vị trí axit amin thứ 157 (K157M) đã dẫn đến hoạt động trans của protein họ bHLH tăng lên gấp 50 lần so với đối chứng [132]. Một gen mã hóa cho protein MYC- RP đƣợc gây đột biến điểm K157M chuyển vào cây thuốc lá, kết quả cho thấy hàm lƣợng anthocyanin tách chiết đƣợc từ cây chuyển gen cao hơn so với cây đối chứng. Các tác giả tiếp tục nghiên cứu trên đối tƣợng cây mõm chó và cây ngô, kết quả đều có sự tƣơng đồng với kết quả thu đƣợc ở cây tía tô. Ngoài methionin, sự thay thế bởi một
số axit amin khác có tác dụng tích cực đối với hoạt động phiên mã. Sự có mặt của axit amin alanin (A159 của MYC- RP trong cây tía tô, A161 của Delila trong cây mõm chó và A172 trong protein Lc của ngô) cũng ảnh hƣởng tới hoạt động trans. Khi axit amin này bị thay thế bởi axit aspartic sẽ làm mất hoạt động trans đối với protein MYC- RP và Delila, làm suy giảm nghiêm trọng hoạt động trans đối với protein Lc. Theo Pattanaik và cộng sự (2006), nếu xảy ra đột biến đồng thời K157M/N354D của Delila dẫn đến gia tăng hoạt động promoter của gen CHS trong cây Arabidopsis [131].
Hình 3.16. Các vùng chức năng của nhân tố bHLH. NLS- tín hiệu định vị nhân (nuclear localization signals); MIR- vùng tương tác với protein MYB (MYB-interacting region); ACT- Vùng giả định (aspartokinase, chorismate mutase, and TyrA domain) [76].
Vùng còn lại có 85 axit amin cuối là vùng giả định ACT có vai trò tạo sự tƣơng thích với DNA, nhƣng không làm ảnh hƣởng đến hoạt động độc lập của ARE [76]. Trong các vùng chức năng trên, vùng cuối có thể điều hòa sự dimer hóa trong tế bào ngô. Sự dimer hóa rất cần thiết cho hoạt động điều hòa của các TFs thuộc họ bHLH. Các kết quả phân tích đột biến vùng này cho thấy, những đột biến E544A hoặc E544R, C547A, R548E, R556E, K562E, và D567K không ảnh hƣởng đến sự dimer hóa của protein trong các thí nghiệm trên đối tƣợng nấm men, mặc dù các axit amin vùng 525- 610 chứa một trong ba tín hiệu định vị nhân của protein [113]. Tuy nhiên, sự dimer hóa hoàn toàn bị loại bỏ nếu thiếu vùng 532-560, làm giảm kích hoạt của promoter A1, và dẫn đến hình thành rất ít tế bào màu đỏ. Trong một nghiên cứu đột biến thực nghiệm khác, khi Ser 560, GLN 562, và Ser 564 đồng thời đƣợc thay thế bằng
Ala, khả năng dimer hóa của protein R bị giảm đáng kể [61]. Khi tạo đột biến thêm ba axit amin vào cấu trúc xoắn thứ hai trong vùng bHLH của protein Lc ở ngô (còn gọi là alen D12), từ axit amin 458 đến 464, kết quả thu đƣợc là sự tƣơng tác của protein bị cản trở và làm suy giảm vai trò hoạt hóa của protein này, có tác động tiêu cực đến sự tích lũy anthocyanin trong tế bào [76].
Thực nghiệm cũng cho rằng, hoạt động của các nhân tố bHLH đƣợc tăng cƣờng cần một trình tự điều hòa cis bảo thủ trên promoter của một số gen cấu trúc tham gia sinh tổng hợp anthocyanin (gọi là yếu tố ARE), khi đó bHLH sẽ tƣơng tác với protein C1 kích hoạt gen A1 [75].
3.4. ĐỊNH LƢỢNG MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN B VÀ LC BẰNG PHẢN ỨNG REAL- TIME PCR
Hai gen B và Lc mã hóa cho hai phân tử protein điều hòa kích hoạt phiên mã của gen chìa khóa trong quá trình sinh tổng hợp anthocyanin. Để định lƣợng mức độ phiên mã của hai gen này ở hai giống ngô chịu hạn tốt có hàm lƣợng anthocyanin cao nhất (NH) và chịu hạn kém có hàm lƣợng anthocyanin thấp nhất (BS1) qua các ngƣỡng xử lý hạn nhân tạo, RNA tổng số của các mẫu đƣợc tách chiết đảm bảo độ tinh sạch và hàm lƣợng để thực hiện phản ứng RT- PCR với mồi Oligo(dT)18. Phản ứng real- time RT- PCR sẽ xác định mức độ phiên mã của hai gen thông qua số lƣợng sản phẩm cDNA tổng hợp đƣợc.
3.4.1. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen B giai đoạn cây con
Protein B có vùng giàu axit amin có tính axit nằm phía trƣớc vùng bHLH. Đầu N và vùng trung tâm của protein rất cần thiết cho chức năng hoạt hóa phiên mã của protein B. Trong khi đầu C của protein B có chứa cấu trúc bHLH, là điểm bám với DNA. Để tìm hiểu tác động của gen B đến sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin khi cây ngô nếp địa phƣơng bị hạn, mức độ phiên mã của gen đƣợc định lƣợng thông qua kỹ thuật real- time RT- PCR ở giống chịu hạn tốt có hàm lƣợng anthocyanin cao nhất (NH) và giống chịu hạn kém
có hàm lƣợng anthocyanin thấp nhất (BS1) qua các ngƣỡng xử lý. Cặp mồi sử dụng để định lƣợng gen này đƣợc thiết kế dựa trên trình tự bảo thủ đã phân lập đƣợc ở hai giống NH và BS1. Với hai cặp mồi của gen tham chiếu Actin
(ActF, ActR) và gen B (BF2, BR2), kết quả của phản ứng real- time RT- PCR đƣợc trình bày ở Bảng 3.9, Hình 3.17 và Hình 3.19.
Bảng 3.9. Chu kỳ ngƣỡng của gen Act và B ở giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo
Ngƣỡng xử lý hạn Giống NH Giống BS1 Ct[B/NH] Ct[Act] Ct Ct[B/BS1] Ct[Act] Ct Trƣớc hạn 40,04±0,05 31,01±0,06 8,95±0,01 40,03±0,04 30,65±0,03 9,37±0,01 Hạn 3 ngày 38,70± 0,06 30,90±0,03 7,79±0,06 39,99±0,04 30,85±0,02 9,14±0,06 ĐC hạn 3 ngày 40,02±0,04 30,77±0,01 9,25±0,05 40,02±0,04 30,63±0,02 9,39±0,02 Hạn 5 ngày 36,75±0,03 30,90±0,01 5,85±0,02 40,03±0,31 30,90±0,01 9,12±0,04 ĐC hạn 5 ngày 39,01±0,02 31,05±0,03 7,95±0,02 40,01±0,02 30,54±0,01 9,26±0,00 Hạn 9 ngày 39,22±0,03 30,91±0,02 8,32±0,02 39,99±0,01 30,52±0,12 9,27±0,02 ĐC hạn 9 ngày 40,01±0,01 30,35±0,01 9,65±0,01 39,95±0,05 30,63±0,03 9,32±0,02
Từ kết quả ở Bảng 3.9, lƣợng mRNA của gen B tăng hay giảm đƣợc tính theo phƣơng pháp của Livak. Kết quả đƣợc minh họa ở Hình 3.17. Đối với giống BS1, mức độ phiên mã của gen B thấp (Ct=40), tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,19 và 1,21 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (chỉ bằng 0,76 lần) so với trƣớc hạn; tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,19 và 1,28 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (chỉ bằng 0,72 lần) so với đối chứng. Đối với giống NH, mức độ phiên mã của gen B cao hơn ở giống BS1 (giá trị Ct từ 36,75 đến 40,04), tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 2,28 và 8,51 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 1,54 lần) so với trƣớc hạn; tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 2,71 và 4,32 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 2,50 lần) so với đối chứng. Kết quả Hình
3.18 chứng tỏ đƣờng biểu diễn phân tích nhiệt độ nóng chảy, đỉnh chảy của cặp mồi gen Actin (ActF, ActR) và gen B (BF2, BR2) sử dụng trong phản ứng real- time RT- PCR rất đặc hiệu.
Ray và cộng sự (2003) sử dụng kỹ thuật real- time RT- PCR nghiên cứu ảnh hƣởng của ba gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin Lc, B- Peru và C1
tách từ ngô trong cây cỏ linh lăng (Medicago sativa). Kết quả cho thấy, mức độ phiên mã của gen Lc tỉ lệ thuận với hàm lƣợng anthocyanin trong điều kiện cƣờng độ ánh sáng mạnh và nhiệt độ thấp. Trong khi đó, cây mang gen B- Peru và C1 đều không có sự thay đổi về kiểu hình mặc dù hai gen này vẫn biểu hiện ở mức độ phát hiện đƣợc [143].
Gen b1 ở ngô gồm các alen B-Peru, B-Bolivia, B-I. Nghiên cứu cho thấy mỗi alen có biểu hiện khác nhau ở mỗi loại mô. Alen B-I đƣợc biểu hiện ở hầu hết các bộ phận của cây nhƣng lại không biểu hiện trong phôi và hạt. Ngƣợc lại, alen B-Peru biểu hiện mạnh mẽ trong hạt giống [127]. Trong nghiên cứu này, mức độ phiên mã của gen B trong thân và bẹ lá cây ngô non bị hạn ở mức thấp có thể có sự tƣơng đồng với gen B- Peru.
Hình 3.17. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen B ở giống ngô NH và BS1. TH: Trước hạn; ĐC: Đối chứng
Hình 3.18. Biểu đồ chảy (A) và Biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen B và Act ở hai giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn. 1- Act ĐC âm; 2- Act/BS1 trước hạn; 3- Act/NH trước hạn ; 4- Act/NH hạn 3 ngày; 5- Act/NH ĐC hạn 3 ngày; 6- Act/NH hạn 5 ngày; 7- Act/NH ĐC 5 ngày; 8- Act/NH hạn 9 ngày; 9- Act/NH ĐC hạn 9 ngày; 10- Act/BS1 hạn 3 ngày; 11- Act/BS1 ĐC hạn 3 ngày; 12- Act/BS1 hạn 5 ngày; 13- Act/BS1 ĐC hạn 5 ngày; 14- Act/BS1 hạn 9 ngày; 15- Act/BS1 ĐC hạn 9 ngày; 16- gen B ĐC âm; 17- BS1 trước hạn; 18- NH trước hạn; 19- NH hạn 3 ngày; 20- NH ĐC hạn 3 ngày; 21- NH hạn 5 ngày; 22- NH ĐC hạn 5 ngày; 23- NH hạn 9 ngày; 24- NH ĐC 9 ngày;25- BS1 hạn 3 ngày; 26- BS1 ĐC hạn 3 ngày; 27- BS1 hạn 5 ngày; 28- BS1 ĐC hạn 5 ngày; 29- BS1 hạn 9 ngày; 30- BS1 ĐC hạn 9 ngày.
B A
Thông thƣờng, gen B-Bolivia cũng biểu hiện cao trong hạt, nhƣng giảm 40% so với B-Peru, và có thể trong một số mô khác. Alen B-Bolivia không đƣợc biểu hiện ở hạt khi nhận đƣợc từ bố; nhƣng khi nhận đƣợc từ mẹ, hạt có màu sắc khác nhau mặc dù có kiểu gen đồng hợp. Xét về đặc điểm phân tử, alen B-Peru và B-Bolivia đều có chung trình tự thƣợng nguồn (upstream region) dài 530bp, nhƣng vùng này khác nhau về trình tự nucleotit (trình tự này có sự tƣơng đồng với các retrotransposon), B-Peru có 534bp đƣợc lặp lại ba lần trong khi B-Bolivia chỉ có 464bp lặp lại. Do vậy, có thể đƣa ra giả thuyết rằng sự biểu hiện của B-Bolivia có thể bị ảnh hƣởng bởi các retrotransposon đƣợc lặp lại liền kề. Mặt khác, thực nghiệm chứng minh rằng nội nhũ mang ba bản sao của B-Bolivia cũng không tổng hợp đƣợc nhiều anthocyanin hơn khi có hai bản sao [151]. Điều này cho thấy sự khác biệt về mức độ phiên mã của gen này không dẫn đến sự khác biệt về hàm lƣợng anthocyanin và ngụ ý B-Bolivia là một gen lặn. Đối với alen B-I, sự có mặt của một số protein liên quan đến việc tạo thành một cấu trúc đa vòng kích hoạt phiên mã. Cấu trúc vòng này đƣợc tạo bởi trình tự lặp lại nằm trƣớc gen 100kb [111]. Sự hình thành cấu trúc đa vòng cũng xảy ra với locus khác cho biết thêm một mức độ phức tạp trong điều hòa biểu hiện gen [170].
Để hiểu đầy đủ cơ chế điều hòa của locus b1, việc xác định các protein tƣơng tác vật lý với protein này là điều cần thiết và là một nhiệm vụ cho các nghiên cứu trong tƣơng lai. Các thí nghiệm chuyển gen phân tích sự đóng góp của từng khu vực để biểu hiện b1 sẽ cung cấp cách nhìn sâu sắc về các chức năng của mỗi alen và sẽ làm sáng tỏ vai trò của tƣơng tác vật lý nói chung.
3.4.2. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen Lc giai đoạn cây con
Hiện nay có nhiều nghiên cứu về gen Lc, đặc biệt là gen Lc của ngô trong quá trình sinh tổng hợp anthocyanin ở các đối tƣợng thực vật khác. Trong đề tài này, để tìm hiểu tác động của gen Lc (bên cạnh gen B) đến sự
biến đổi hàm lƣợng anthocyanin khi cây ngô nếp địa phƣơng bị hạn, mức độ phiên mã của gen đƣợc định lƣợng thông qua kỹ thuật real- time RT- PCR. Cặp mồi sử dụng để định lƣợng gen này đƣợc thiết kế dựa trên trình tự bảo thủ đã phân lập đƣợc ở hai giống NH và BS1. Với hai cặp mồi của gen tham chiếu Actin (ActF, ActR) và gen Lc (LcF2, LcR2), kết quả của phản ứng real- time RT- PCR đƣợc trình bày ở Bảng 3.10, Hình 3.19 và Hình 3.20.
Bảng 3.10. Chu kỳ ngƣỡng của gen Act và Lc ở giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo
Ngƣỡng xử lý hạn Giống NH Giống BS1 Ct[Lc/NH] Ct[Act] Ct Ct[Lc/BS1] Ct[Act] Ct Trƣớc hạn 30,60±0,02 29,56±0,01 0,98±0,03 31,92±0,00 30,45±0,00 1,47±0,01 Hạn 3 ngày 30,32±0,01 30,86±0,03 -0,54±0,02 31,78±0,01 31,07±0,01 0,71±0,00 ĐC hạn 3 ngày 30,82±0,01 30,17±0,01 0,65±0,02 32,18±0,00 30,64±0,00 1,53±0,00 Hạn 5 ngày 29,93±0,02 30,75±0,01 -0,82±0,01 31,69±0,01 31,25±0,01 0,43±0,02 ĐC hạn 5 ngày 34,20±0,03 30,78±0,00 3,42±0,01 32,08±0,01 30,62±0,02 1,46±0,01 Hạn 9 ngày 29,69±0,02 30,87±0,01 -1,18±0,02 31,74±0,00 30,61±0,01 1,12±0,00 ĐC hạn 9 ngày 30,95±0,03 30,26±0,02 0,69±0,01 32,61±0,00 30,97±0,01 1,64±0,03
Từ kết quả Bảng 3.10, lƣợng mRNA của gen Lc tăng hay giảm đƣợc tính theo phƣơng pháp của Livak. Kết quả đƣợc minh họa ở Hình 3.19. Đối với giống BS1, mức độ phiên mã của gen Lc có giá trị Ct từ 31,69 đến 32,61, tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,68 và 2,08 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 1,26 lần) so với trƣớc hạn; tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,77 và 2,10 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 1,40 lần) so với đối chứng. Đối với giống NH, mức độ phiên mã của gen Lc cao hơn ở giống BS1 (giá trị Ct từ 29,69 đến 30,32), tăng ở ngƣỡng sau hạn 3
ngày và 5 ngày (gấp 2,99 và 3,63 lần), sau hạn 9 ngày gấp 4,66 lần so với trƣớc hạn; tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 2,28 và 18,90 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 3,36 lần) so với đối chứng. Kết quả Hình 3.20 chứng tỏ đƣờng biểu diễn phân tích nhiệt độ nóng chảy, đỉnh chảy của cặp mồi gen Actin (ActF, ActR) và gen Lc (LcF2, LcR2) sử dụng trong phản ứng real- time RT- PCR rất đặc hiệu.
Hình 3.19. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen Lc ở giống ngô NH và BS1. TH: Trước hạn; ĐC: Đối chứng
Nhƣ vậy, kết quả real- time RT- PCR cho thấy: có sự chênh lệch về mức độ phiên mã của gen B và Lc ở mẫu chịu hạn tốt so với ở mẫu chịu hạn kém. Tuy nhiên, giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) của phản ứng real- time RT- PCR gen B
lại cao hơn so với gen Lc, chứng tỏ lƣợng sản phẩm mRNA của gen Lc nhiều hơn, và gen này hoạt động mạnh hơn.
Hình 3.20. Biểu đồ chảy (A) và Biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen Act và Lc ở hai giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn. 1- Act ĐC âm; 2- Act/BS1 trước hạn; 3- Act/BS1 hạn 3 ngày; 4- Act/BS1 ĐC hạn 3 ngày; 5- Act/BS1 hạn 5 ngày; 6- Act/BS1 ĐC hạn 5 ngày; 7- Act/BS1 hạn 9 ngày; 8- Act/BS1 ĐC hạn 9 ngày; 9- Act/NH trước hạn; 10- Act/NH hạn 3 ngày; 11- Act/NH ĐC hạn 3 ngày; 12- Act/NH ĐC hạn 9 ngày; 13- Act/NH hạn 9 ngày; 14- Act/NH ĐC 5 ngày; 15- Act/NH hạn 5 ngày; 16- Lc ĐC âm; 17- BS1 trước hạn; 18- BS1 ĐC hạn 3 ngày; 19- BS1 ĐC hạn 5 ngày; 20- BS1 ĐC hạn 9 ngày; 21- BS1 hạn 3 ngày; 22- BS1 hạn 5 ngày; 23- BS1 hạn 9 ngày; 24- NH trước hạn; 25- NH hạn 3 ngày; 26- NH ĐC hạn 3 ngày; 27- NH