5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.4.2. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen Lc giai đoạn cây con
Hiện nay có nhiều nghiên cứu về gen Lc, đặc biệt là gen Lc của ngô trong quá trình sinh tổng hợp anthocyanin ở các đối tƣợng thực vật khác. Trong đề tài này, để tìm hiểu tác động của gen Lc (bên cạnh gen B) đến sự
biến đổi hàm lƣợng anthocyanin khi cây ngô nếp địa phƣơng bị hạn, mức độ phiên mã của gen đƣợc định lƣợng thông qua kỹ thuật real- time RT- PCR. Cặp mồi sử dụng để định lƣợng gen này đƣợc thiết kế dựa trên trình tự bảo thủ đã phân lập đƣợc ở hai giống NH và BS1. Với hai cặp mồi của gen tham chiếu Actin (ActF, ActR) và gen Lc (LcF2, LcR2), kết quả của phản ứng real- time RT- PCR đƣợc trình bày ở Bảng 3.10, Hình 3.19 và Hình 3.20.
Bảng 3.10. Chu kỳ ngƣỡng của gen Act và Lc ở giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo
Ngƣỡng xử lý hạn Giống NH Giống BS1 Ct[Lc/NH] Ct[Act] Ct Ct[Lc/BS1] Ct[Act] Ct Trƣớc hạn 30,60±0,02 29,56±0,01 0,98±0,03 31,92±0,00 30,45±0,00 1,47±0,01 Hạn 3 ngày 30,32±0,01 30,86±0,03 -0,54±0,02 31,78±0,01 31,07±0,01 0,71±0,00 ĐC hạn 3 ngày 30,82±0,01 30,17±0,01 0,65±0,02 32,18±0,00 30,64±0,00 1,53±0,00 Hạn 5 ngày 29,93±0,02 30,75±0,01 -0,82±0,01 31,69±0,01 31,25±0,01 0,43±0,02 ĐC hạn 5 ngày 34,20±0,03 30,78±0,00 3,42±0,01 32,08±0,01 30,62±0,02 1,46±0,01 Hạn 9 ngày 29,69±0,02 30,87±0,01 -1,18±0,02 31,74±0,00 30,61±0,01 1,12±0,00 ĐC hạn 9 ngày 30,95±0,03 30,26±0,02 0,69±0,01 32,61±0,00 30,97±0,01 1,64±0,03
Từ kết quả Bảng 3.10, lƣợng mRNA của gen Lc tăng hay giảm đƣợc tính theo phƣơng pháp của Livak. Kết quả đƣợc minh họa ở Hình 3.19. Đối với giống BS1, mức độ phiên mã của gen Lc có giá trị Ct từ 31,69 đến 32,61, tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,68 và 2,08 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 1,26 lần) so với trƣớc hạn; tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,77 và 2,10 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 1,40 lần) so với đối chứng. Đối với giống NH, mức độ phiên mã của gen Lc cao hơn ở giống BS1 (giá trị Ct từ 29,69 đến 30,32), tăng ở ngƣỡng sau hạn 3
ngày và 5 ngày (gấp 2,99 và 3,63 lần), sau hạn 9 ngày gấp 4,66 lần so với trƣớc hạn; tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 2,28 và 18,90 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 3,36 lần) so với đối chứng. Kết quả Hình 3.20 chứng tỏ đƣờng biểu diễn phân tích nhiệt độ nóng chảy, đỉnh chảy của cặp mồi gen Actin (ActF, ActR) và gen Lc (LcF2, LcR2) sử dụng trong phản ứng real- time RT- PCR rất đặc hiệu.
Hình 3.19. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen Lc ở giống ngô NH và BS1. TH: Trước hạn; ĐC: Đối chứng
Nhƣ vậy, kết quả real- time RT- PCR cho thấy: có sự chênh lệch về mức độ phiên mã của gen B và Lc ở mẫu chịu hạn tốt so với ở mẫu chịu hạn kém. Tuy nhiên, giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) của phản ứng real- time RT- PCR gen B
lại cao hơn so với gen Lc, chứng tỏ lƣợng sản phẩm mRNA của gen Lc nhiều hơn, và gen này hoạt động mạnh hơn.
Hình 3.20. Biểu đồ chảy (A) và Biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen Act và Lc ở hai giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn. 1- Act ĐC âm; 2- Act/BS1 trước hạn; 3- Act/BS1 hạn 3 ngày; 4- Act/BS1 ĐC hạn 3 ngày; 5- Act/BS1 hạn 5 ngày; 6- Act/BS1 ĐC hạn 5 ngày; 7- Act/BS1 hạn 9 ngày; 8- Act/BS1 ĐC hạn 9 ngày; 9- Act/NH trước hạn; 10- Act/NH hạn 3 ngày; 11- Act/NH ĐC hạn 3 ngày; 12- Act/NH ĐC hạn 9 ngày; 13- Act/NH hạn 9 ngày; 14- Act/NH ĐC 5 ngày; 15- Act/NH hạn 5 ngày; 16- Lc ĐC âm; 17- BS1 trước hạn; 18- BS1 ĐC hạn 3 ngày; 19- BS1 ĐC hạn 5 ngày; 20- BS1 ĐC hạn 9 ngày; 21- BS1 hạn 3 ngày; 22- BS1 hạn 5 ngày; 23- BS1 hạn 9 ngày; 24- NH trước hạn; 25- NH hạn 3 ngày; 26- NH ĐC hạn 3 ngày; 27- NH ĐC hạn 9 ngày; 28- NH hạn 9 ngày; 29- NH ĐC 5 ngày; 30- NH hạn 5 ngày.
A
tổng hợp anthocyanin tăng mạnh mẽ khi xử lý hạn sinh lý bởi đƣờng, tăng cả tích lũy mRNA của các gen quy định enzyme tham gia chuyển hóa và hàm lƣợng của chúng trong tế bào. Điều này cũng đƣợc khẳng định rất rõ trên đối tƣợng Arabidopsis thaliana, Petunia, nho, cà chua. Gen điều hòa tổng hợp anthocyanin ở ngô Lc đƣợc Lloyd và cộng sự biểu hiện lần đầu tiên trong cây thuốc lá và Arabidopsis. Các tác giả nhận thấy dòng thuốc lá chuyển gen hiển thị sắc tố màu đỏ tƣơi ở tràng hoa và bao phấn; dòng Arabidopsis biến đổi gen có hàm lƣợng anthocyanin cao hơn trong lá, thân, lá đài, và nhụy hoa so với đối chứng. Li và cộng sự (2008) thu đƣợc 24 cây thuốc lá chuyển gen Lc và sản xuất đƣợc hạt giống T2. Kết quả này cho thấy, gen Lc hoạt hóa sự biểu hiện của gen cấu trúc CHS ở mức độ cao và các sản phẩm của gen không gây ra hiện tƣợng bất dục đực. Trong khi, ở cây lúa chuyển gen này có sự bất thƣờng về giao tử thể đực (male gametophytes) và hạt gây ra hiện tƣợng bất thụ. Một giả thuyết đƣợc đƣa ra là có sự khác biệt giữa cây Một lá mầm (lúa) và cây Hai lá mầm (thuốc lá) liên quan đến cơ chế bất thụ gây ra bởi các enzyme tham gia vào sinh tổng hợp flavonoid [98], [99].
Flachowsky và cộng sự (2007 và 2010) tiến hành chuyển gen Lc của ngô vào cây táo (Malus domestica cv. „Holsteiner Cox‟). Kết quả phân tích real- time PCR cho thấy, sự biểu hiện gen Lc giảm dần theo thứ tự T2> T5> T1> T3>T4 và không biểu hiện ở đối chứng. Sự biểu hiện của gen đƣợc chuyển rất cao, làm tăng mạnh mẽ hàm lƣợng anthocyanin và proanthocyanidin (gấp từ 7 đến 134 lần tùy mỗi loại) [97]. Mức độ phiên mã của các gen cấu trúc PAL, CHS, FHT, DFR, LAR, ANS và ANR cũng tăng so với đối chứng mặc dù các cây chuyển gen chỉ chứa một hoặc hai bản sao gen Lc. Những cây này giảm về kích thƣớc, tính hƣớng của chồi bên, sự phát triển của túm lông, đƣờng kính chồi và lá bất thƣờng. Kiểu hình này do ảnh hƣởng trực tiếp hoặc gián tiếp của sự vận chuyển auxin trong cây chuyển gen [62]. Nhóm tác giả Bovy
vào cây cà chua bằng kỹ thuật real-time PCR với chất phát huỳnh quang là Taqman. Kết quả thu đƣợc là số cây đƣợc biểu hiện cả hai gen nhiều hơn so với số cây đơn gen Lc hoặc C1, và lƣợng flavonoid trong các cây chuyển gen cũng tăng lên gấp 60 lần. Nhóm tác giả tiếp tục tiến hành phản ứng real-time RT- PCR với chất phát huỳnh quang là SYBR- Green để kiểm tra ảnh hƣởng của Lc và C1 tới sự biểu hiện của các gen tham gia tổng hợp flavonoid [39]. Mức độ phiên mã của các gen PAL, F3H, F3'H, FLS, GT và RT tăng lên trong quá trình chín quả, giảm dần trong giai đoạn chín đỏ. Mức độ biểu hiện của
CHS và CHI thấp trong trái xanh, tƣơng ứng với lƣợng flavonoid thấp [121]. Khi quả chín dần, sự biểu hiện của CHS tăng gấp hơn 100 lần, trong khi CHI
vẫn biểu hiện ở mức thấp. Các gen cần thiết cho việc sản xuất anthocyanin lá (F3'5'H, DFR, và ANS) không đƣợc biểu hiện trong vỏ quả cà chua. Trong thịt quả những cây đối chứng, các gen biểu hiện rất thấp. Từ những kết quả này cho thấy sự biểu hiện cao của gen Lc và C1 của ngô dẫn đến cảm ứng tất cả các gen cấu trúc tham gia sinh tổng hợp anthocyanin trong cây cà chua chuyển gen, và hai gen này biểu hiện cao trong quả hơn trong lá.
Tuy nhiên, Ray và cộng sự (2003) đã chứng minh rằng: chuyển gen B- peru và C1 vào quần thể cỏ linh lăng thì các gen này không biểu hiện kiểu hình rõ trong điều kiện cƣờng độ ánh sáng cao hay nhiệt độ thấp; nhƣng các dòng chuyển gen Lc biểu hiện mạnh sắc tố màu đỏ/ tím, tƣơng tự ở cây dạ yên thảo [143]. Gen Lc đã tăng cƣờng đáng kể lƣợng anthocyanin trong tất cả các mô thực vật màu xanh, bao gồm cả rễ, lá đài, và gân cánh hoa. Việc sử dụng gen Lc của ngô nhƣ một gen đánh dấu mạnh mẽ để tăng tổng hợp anthocyanin cũng đang đƣợc tiến hành trên một số đối tƣợng cây trồng nhằm tạo ra các loại thực phẩm vừa có lợi cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng, vừa có tiềm năng kinh tế cho ngƣời sản xuất, và vừa có lợi cho sự chống chịu với điều kiện cực đoan cho bản thân cây trồng.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận
1. Thông qua xử lý hạn nhân tạo ở giai đoạn hạt nảy mầm và cây non 3 lá, 10 giống ngô đƣợc phân thành ba nhóm: chịu hạn tốt (Mo, TB, NH), chịu hạn trung bình (BN, DG2, PT), chịu hạn kém (BS1, VK2, ĐX2, KL). Giống NH có khả năng chịu hạn cao nhất (chỉ số chịu hạn tƣơng đối là 18365,61), giống BS1 và VK2 có khả năng chịu hạn kém nhất (chỉ số chịu hạn tƣơng đối là 9789,72 và 10340,04).
2. Khi cây ngô non bị hạn, hàm lƣợng anthocyanin đƣợc tích lũy cao nhất trong thân và bẹ lá. Hàm lƣợng anthocyanin tăng rõ rệt nhất từ 1 ngày đến 5 ngày bị hạn. Sự biến động hàm lƣợng anthocyanin có mối tƣơng quan thuận với tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra (hệ số tƣơng quan từ 0,72 đến 0,99). Qua đó, anthocyanin đƣợc coi là một trong những chỉ thị cho đặc tính chịu hạn ở cây ngô non.
3. Tách dòng thành công và xác định đƣợc trình tự hai đoạn gen có chức năng điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô gồm đoạn gen B dài 801 bp, mã hóa cho 267 axit amin; đoạn gen Lc dài822 bp, mã hóa cho 273 axit amin. 4. Bằng kỹ thuật real- time RT- PCR đã xác định đƣợc mức độ phiên mã của hai gen B và Lc ở giống ngô NH và BS1 tăng khi cây ngô bị hạn và tăng đến sau hạn 5 ngày, sau đó giảm. Mức độ phiên mã của gen B và Lc ở giống NH cao hơn ở BS1, gen Lc biểu hiện mạnh hơn (giá trị Ct từ 29,65 đến 34,20) so với gen B (giá trị Ct từ 36,75 đến 40,04). Mức độ phiên mã của gen B và Lc
đƣợc xem là một trong những chỉ thị cho đặc tính chịu hạn ở cây ngô non.
Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu chức năng điều hòa của hai gen này đối với các gen cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp anthocyanin khi cây ngô bị hạn.
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN
1. Phạm Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Thị Hồng Chuyên (2010), “Đánh giá chất lƣợng hạt và khả năng chịu hạn của một số giống ngô nếp địa phƣơng giai đoạn hạt nảy mầm”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên,
103- 109.
2. Phạm Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Hữu Cƣờng, Lê Trần Bình (2011), “Tách chiết và phân tích hàm lƣợng anthocyanin từ các mẫu thực vật khác nhau”.
Tạp chí Sinh học, 33(4), 79- 85.
3. Phạm Thị Thanh Nhàn, Trần Thị Mỹ Linh, Lê Trần Bình (2013), “Tách dòng phân tử mang đoạn gen Lc hoạt hóa sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phƣơng (Zea mays subsp. ceratina (Kuelshov) Zhuk)”. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, 960- 964.
4. Phạm Thị Thanh Nhàn, Lê Xuân Đắc, Lê Trần Bình (2013), “Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin và khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng giai đoạn cây non”, Tạp chí Sinh học, 35SE, 174- 183.
5. Công bố 03 trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI)
(1) Pham Thi N. T., Le D. H., Hoang H. Le S. V. and Le B. T. (2013), Cloning a segment of Actin gene in local maize cultivar NaHao from Vietnam, NCBI, LOCUS KF970708.
(2) Pham Thi N. T. and Le B. T. (2013), Cloning gene segment containing sequence of B gene activates anthocyanin biosynthesis in local sticky corn cultivar, cultivar NaHao (Zea mays subsp. ceratina (Kuelshov) Zhuk), NCBI, LOCUS KF835722.
(3) Pham Thi N. T. and Le B. T. (2013), Cloning gene segment containing sequence of B gene activates anthocyanin biosynthesis in local sticky corn cultivar, cultivar BS1 (Zea mays subsp. ceratina (Kuelshov) Zhuk), NCBI, LOCUS KF835723.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và tách dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nhà xuất bản Đại học quốc gia, Hà Nội. 2. Phạm Thị Trân Châu và Trần Thị Áng (1997), Thực hành hoá sinh học,
Nhà xuất bản Giáo dục.
3. Huỳnh Thị Kim Cúc, Nguyễn Thị Lan, Châu Thể Liễu Trang (2005), “Tối ƣu hóa điều kiện chiết tách chất màu anthocyanin từ bắp cải tím trong môi trƣờng trung tính”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 4(12), 44-50.
4. Huỳnh Thị Kim Cúc (2007), Nghiên cứu thu nhận và ứng dụng anthocyanin công nghệ thực phẩm, Luận án Tiến sĩ, Đại học Đà Nẵng. 5. Lê Huy Hàm, Đoàn Đình Long, Lê Thu Về, Đỗ Năng Vịnh (2003),
“Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất dòng thuần ở ngô bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn”, Báo cáo khoa học toàn quốc, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 754- 760.
6. Nguyễn Thị Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Sâm (2003), “Nghiên cứu một số đặc điểm hóa sinh trong giai đoạn hạt nảy mầm và cây non của một số giống lạc (Archis hypogaea L.)”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 315- 318.
7. Nguyễn Thế Hùng, Nguyễn Thiện Huyên, Nguyễn Văn Lộc, Bùi Mạnh Cƣờng (2010), “Kết quả chọn tạo giống ngô nếp lai (Zea mays ceraina kalesh) giai đoạn 2005- 2008 tại trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội”,
Tạp chí Khoa học và Phát triển, 8(6), 890- 899.
liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển gen vào cây đậu tương, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên.
9. Trần Thị Phƣơng Liên, Nguyễn Đăng Tôn, Lƣơng Thị Thu Hƣờng, Bùi Mạnh Cƣờng, Ngô Hữu Tình (2005), “Phân lập gen dehydrin của ngô”,
Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(3), 347-352.
10.Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein và tính chống chịu ở thực vật, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ, 346tr.
11.Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình cây ngô, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
12.Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong chọn giống cây trồng, Nhà xuất bản Đại học Thái Nguyên, 23- 41.
13.Chu Hoàng Mậu, Ngô Việt Anh (2005), “Đánh giá chất lƣợng hạt và khả năng phản ứng đối với hạn của một số giống ngô địa phƣơng miền núi”,
Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn số 66, 20- 22.
14.Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng (2006), “Thành phần axit amin và khả năng chịu hạn của một số giống đậu tƣơng địa phƣơng của tỉnh Sơn La”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 94(2), 22- 26.
15.Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội.
16.Nguyễn Thị Thu Ngà, Lê Trần Bình (2011), “Phân nhóm các giống lạc theo khả năng chịu hạn khác nhau”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 167, 46- 54.
17.Phạm Đồng Quảng, Lê Quí Tƣờng, Nguyễn Quốc Lý (2005), “Kết quả điều tra giống cây trồng trên cả nƣớc năm 2003 – 2004”, Tạp chí Khoa học công nghệ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 56- 62.
18.Dƣơng Văn Sơn (1996), Nghiên cứu một số vật liệu ngô chịu hạn nhập nội sử dụng trong công tác chọn tạo giống, Luận án PTS khoa học nông nghiệp.
19.Phạm Thị Lý Thu, Phạm Văn Thợi, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2005), “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen ở ngô”,
Tạp chí Sinh học, số 3, 27- 35.
20.Ngô Hữu Tình, Nguyễn Thị Lƣu (1990), “Kết quả nghiên cứu chọn tạo giống ngô tổng hợp nếp trắng”, Tạp chí Nông nghiệp công nghiệp thực phẩm, số 12, 704 – 705.
21.Ngô Hữu Tình, Bùi Mạnh Cƣờng, Ngô Thị Minh Tâm, Ngụy Hƣơng Lan, Đinh Công Chính, Lê Trần Bình, Đinh Thị Phòng (2003), “Chọn tạo dòng ngô thuần bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn”, Báo cáo khoa học toàn quốc, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 862- 865.
22.Tổng cục thống kê (8/2013), Niên giám thống kê 2012, Nhà xuất bản Thống kê, Hà Nội.
23.Phạm Hùng Vân (2009), PCR và Real-time PCR, Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thƣờng gặp. Nhà xuất bản Y học.
24.Phan Thị Vân, Ngô Hữu Tình, Luân Thị Đẹp (2005), “Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các dòng và các tổ hợp ngô lai luân giao ở giai đoạn cây