5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.4.1. Định lƣợng mức độ biểu hiện của ge nB giai đoạn cây con
Protein B có vùng giàu axit amin có tính axit nằm phía trƣớc vùng bHLH. Đầu N và vùng trung tâm của protein rất cần thiết cho chức năng hoạt hóa phiên mã của protein B. Trong khi đầu C của protein B có chứa cấu trúc bHLH, là điểm bám với DNA. Để tìm hiểu tác động của gen B đến sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin khi cây ngô nếp địa phƣơng bị hạn, mức độ phiên mã của gen đƣợc định lƣợng thông qua kỹ thuật real- time RT- PCR ở giống chịu hạn tốt có hàm lƣợng anthocyanin cao nhất (NH) và giống chịu hạn kém
có hàm lƣợng anthocyanin thấp nhất (BS1) qua các ngƣỡng xử lý. Cặp mồi sử dụng để định lƣợng gen này đƣợc thiết kế dựa trên trình tự bảo thủ đã phân lập đƣợc ở hai giống NH và BS1. Với hai cặp mồi của gen tham chiếu Actin
(ActF, ActR) và gen B (BF2, BR2), kết quả của phản ứng real- time RT- PCR đƣợc trình bày ở Bảng 3.9, Hình 3.17 và Hình 3.19.
Bảng 3.9. Chu kỳ ngƣỡng của gen Act và B ở giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo
Ngƣỡng xử lý hạn Giống NH Giống BS1 Ct[B/NH] Ct[Act] Ct Ct[B/BS1] Ct[Act] Ct Trƣớc hạn 40,04±0,05 31,01±0,06 8,95±0,01 40,03±0,04 30,65±0,03 9,37±0,01 Hạn 3 ngày 38,70± 0,06 30,90±0,03 7,79±0,06 39,99±0,04 30,85±0,02 9,14±0,06 ĐC hạn 3 ngày 40,02±0,04 30,77±0,01 9,25±0,05 40,02±0,04 30,63±0,02 9,39±0,02 Hạn 5 ngày 36,75±0,03 30,90±0,01 5,85±0,02 40,03±0,31 30,90±0,01 9,12±0,04 ĐC hạn 5 ngày 39,01±0,02 31,05±0,03 7,95±0,02 40,01±0,02 30,54±0,01 9,26±0,00 Hạn 9 ngày 39,22±0,03 30,91±0,02 8,32±0,02 39,99±0,01 30,52±0,12 9,27±0,02 ĐC hạn 9 ngày 40,01±0,01 30,35±0,01 9,65±0,01 39,95±0,05 30,63±0,03 9,32±0,02
Từ kết quả ở Bảng 3.9, lƣợng mRNA của gen B tăng hay giảm đƣợc tính theo phƣơng pháp của Livak. Kết quả đƣợc minh họa ở Hình 3.17. Đối với giống BS1, mức độ phiên mã của gen B thấp (Ct=40), tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,19 và 1,21 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (chỉ bằng 0,76 lần) so với trƣớc hạn; tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,19 và 1,28 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (chỉ bằng 0,72 lần) so với đối chứng. Đối với giống NH, mức độ phiên mã của gen B cao hơn ở giống BS1 (giá trị Ct từ 36,75 đến 40,04), tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 2,28 và 8,51 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 1,54 lần) so với trƣớc hạn; tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 2,71 và 4,32 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 2,50 lần) so với đối chứng. Kết quả Hình
3.18 chứng tỏ đƣờng biểu diễn phân tích nhiệt độ nóng chảy, đỉnh chảy của cặp mồi gen Actin (ActF, ActR) và gen B (BF2, BR2) sử dụng trong phản ứng real- time RT- PCR rất đặc hiệu.
Ray và cộng sự (2003) sử dụng kỹ thuật real- time RT- PCR nghiên cứu ảnh hƣởng của ba gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin Lc, B- Peru và C1
tách từ ngô trong cây cỏ linh lăng (Medicago sativa). Kết quả cho thấy, mức độ phiên mã của gen Lc tỉ lệ thuận với hàm lƣợng anthocyanin trong điều kiện cƣờng độ ánh sáng mạnh và nhiệt độ thấp. Trong khi đó, cây mang gen B- Peru và C1 đều không có sự thay đổi về kiểu hình mặc dù hai gen này vẫn biểu hiện ở mức độ phát hiện đƣợc [143].
Gen b1 ở ngô gồm các alen B-Peru, B-Bolivia, B-I. Nghiên cứu cho thấy mỗi alen có biểu hiện khác nhau ở mỗi loại mô. Alen B-I đƣợc biểu hiện ở hầu hết các bộ phận của cây nhƣng lại không biểu hiện trong phôi và hạt. Ngƣợc lại, alen B-Peru biểu hiện mạnh mẽ trong hạt giống [127]. Trong nghiên cứu này, mức độ phiên mã của gen B trong thân và bẹ lá cây ngô non bị hạn ở mức thấp có thể có sự tƣơng đồng với gen B- Peru.
Hình 3.17. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen B ở giống ngô NH và BS1. TH: Trước hạn; ĐC: Đối chứng
Hình 3.18. Biểu đồ chảy (A) và Biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen B và Act ở hai giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn. 1- Act ĐC âm; 2- Act/BS1 trước hạn; 3- Act/NH trước hạn ; 4- Act/NH hạn 3 ngày; 5- Act/NH ĐC hạn 3 ngày; 6- Act/NH hạn 5 ngày; 7- Act/NH ĐC 5 ngày; 8- Act/NH hạn 9 ngày; 9- Act/NH ĐC hạn 9 ngày; 10- Act/BS1 hạn 3 ngày; 11- Act/BS1 ĐC hạn 3 ngày; 12- Act/BS1 hạn 5 ngày; 13- Act/BS1 ĐC hạn 5 ngày; 14- Act/BS1 hạn 9 ngày; 15- Act/BS1 ĐC hạn 9 ngày; 16- gen B ĐC âm; 17- BS1 trước hạn; 18- NH trước hạn; 19- NH hạn 3 ngày; 20- NH ĐC hạn 3 ngày; 21- NH hạn 5 ngày; 22- NH ĐC hạn 5 ngày; 23- NH hạn 9 ngày; 24- NH ĐC 9 ngày;25- BS1 hạn 3 ngày; 26- BS1 ĐC hạn 3 ngày; 27- BS1 hạn 5 ngày; 28- BS1 ĐC hạn 5 ngày; 29- BS1 hạn 9 ngày; 30- BS1 ĐC hạn 9 ngày.
B A
Thông thƣờng, gen B-Bolivia cũng biểu hiện cao trong hạt, nhƣng giảm 40% so với B-Peru, và có thể trong một số mô khác. Alen B-Bolivia không đƣợc biểu hiện ở hạt khi nhận đƣợc từ bố; nhƣng khi nhận đƣợc từ mẹ, hạt có màu sắc khác nhau mặc dù có kiểu gen đồng hợp. Xét về đặc điểm phân tử, alen B-Peru và B-Bolivia đều có chung trình tự thƣợng nguồn (upstream region) dài 530bp, nhƣng vùng này khác nhau về trình tự nucleotit (trình tự này có sự tƣơng đồng với các retrotransposon), B-Peru có 534bp đƣợc lặp lại ba lần trong khi B-Bolivia chỉ có 464bp lặp lại. Do vậy, có thể đƣa ra giả thuyết rằng sự biểu hiện của B-Bolivia có thể bị ảnh hƣởng bởi các retrotransposon đƣợc lặp lại liền kề. Mặt khác, thực nghiệm chứng minh rằng nội nhũ mang ba bản sao của B-Bolivia cũng không tổng hợp đƣợc nhiều anthocyanin hơn khi có hai bản sao [151]. Điều này cho thấy sự khác biệt về mức độ phiên mã của gen này không dẫn đến sự khác biệt về hàm lƣợng anthocyanin và ngụ ý B-Bolivia là một gen lặn. Đối với alen B-I, sự có mặt của một số protein liên quan đến việc tạo thành một cấu trúc đa vòng kích hoạt phiên mã. Cấu trúc vòng này đƣợc tạo bởi trình tự lặp lại nằm trƣớc gen 100kb [111]. Sự hình thành cấu trúc đa vòng cũng xảy ra với locus khác cho biết thêm một mức độ phức tạp trong điều hòa biểu hiện gen [170].
Để hiểu đầy đủ cơ chế điều hòa của locus b1, việc xác định các protein tƣơng tác vật lý với protein này là điều cần thiết và là một nhiệm vụ cho các nghiên cứu trong tƣơng lai. Các thí nghiệm chuyển gen phân tích sự đóng góp của từng khu vực để biểu hiện b1 sẽ cung cấp cách nhìn sâu sắc về các chức năng của mỗi alen và sẽ làm sáng tỏ vai trò của tƣơng tác vật lý nói chung.