5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.2.2. Nhân tố phiên mã tham gia quá trình tổng hợp anthocyanin
Sinh tổng hợp anthocyanin đƣợc nghiên cứu đầu tiên trên đối tƣợng Zea mays. Sự có mặt của anthocyanin là kết quả của một chuỗi các phản ứng hoá sinh có sự xúc tác của các enzyme đƣợc mã hoá bởi các gen CHS (hay gen C2),
DFR (hay gen A1), CHI, F3’H, F3’5’H, ANS, 3GT (hay gen bronze1- Bz1). Đó là các gen cấu trúc. Các sản phẩm enzyme của chúng rất quan trọng trong việc xác định màu hoa, quả và các mô tế bào khác [99], [163].
Nếu nhƣ enzyme CHS đƣợc coi là enzyme “chìa khóa” mở ra con đƣờng sinh tổng hợp anthocyanin, thì enzyme DFR hỗ trợ hình thành các màu chỉ thị.
Chính vì vậy mà các đột biến gen DFR đều cho ra những hoa có màu trắng [145]. Gen CHS bị ức chế sẽ làm giảm quá trình sinh tổng hợp anthocyanin, thậm chí không có flavonoid [174].
Hình 1.5. Ba nhóm gen điều hòa tham gia tổng hợp anthocyanin ở ngô (theo Hartmann và cộng sự, 2005 [73]). ACE (ACGT- containing element): điểm bám của bZip; MRE (MYB-recognition element), RRE (R response element): điểm nhận biết và bám của MYB và bHLH); Anthocyanin structural gene: gen cấu trúc.
Sự biểu hiện của các gen cấu trúc trong quá trình sinh tổng hợp anthocyanin ở các bộ phận cây ngô rất cần sự có mặt của các TFs thuộc họ MYB, MYC (hay bHLH) và WD40 [68], [82]. Giới Thực vật có khoảng hơn 100 gen MYB, và MYC [156].
Nhóm WD40: các protein thuộc nhóm này có cấu trúc lặp lại ngắn khoảng 40 axit amin và thƣờng kết thúc bởi cặp tryptophan- aspartate (W-D) [159]. Các bản sao lặp lại đƣợc gấp cuộn tạo thành vòng, gọi là vùng WD40. Các protein WD40 chứa 4 đến 16 đơn vị lặp đi lặp lại (thƣờng là 7), các đơn vị xoắn kiểu nếp gấp bê-ta bởi liên kết hyđro mạnh mẽ và tạo cấu trúc cánh quạt ổn định [176]. WD40 là một họ protein lớn đƣợc tìm thấy trong tất cả các sinh vật nhân chuẩn và liên quan đến một loạt chức năng khác nhau, từ truyền tín hiệu và điều chỉnh phiên mã đến kiểm soát chu kì tế bào. Để thực hiện đƣợc các chức năng này, chúng thƣờng tạo phức với các protein khác, trong đó các đơn vị lặp lại nhƣ một giàn giáo vững chắc cho các tƣơng tác của protein. Ví dụ nhƣ các phức hợp protein Gβ, yếu tố phiên mã TAF II, và E3 ubiquitin ligase [96].
tạo nhiều con đƣờng khác nhau trong tế bào, trong đó có con đƣờng anthocyanin. Các báo cáo khoa ho ̣c gần đây đã đƣa ra nhiều mô hình hoạt động của phức hợp protein này dẫn đến số phận khác nhau của tế bào. Một số protein WD40 gây ảnh hƣởng đến những đặc điểm tế bào biểu bì đã đƣợc xác định ở cây dã yên thảo (AN11), Arabidopsis (TTG1), tía tô (PFWD) và ngô (PAC1). Các protein này tƣơng tác với protein Lc gây ảnh hƣởng đến đặc điểm lớp biểu bì và hàm lƣợng sắc tố anthocyanin ở cây Arabidopsis [141].
MYB (Myeloblastosis) là một họ protein lớn, có chức năng đa dạng và có mặt trong tất cả sinh vật nhân chuẩn. Protein MYB là nhân tố điều hòa quan trọng trong sự phát triển, trao đổi chất, tạo hình dạng tế bào, kháng bệnh và phản ứng với điều kiện cực đoan. Các protein MYB đƣợc đặc trƣng bởi ba vùng lặp lại có cấu trúc không gian kiểu “helix-turn-helix” (xoắn- chuyển- xoắn), dài khoảng 50 axit amin và giàu tryptophan. Ba trình tự lặp lại trong protein MYB đƣợc gọi là R1, R2 và R3 (repeat). Các protein MYB khác nhau là do sự có mặt của ba trình tự này, ví dụ nhƣ MYB1R, MYB3R hay R2R3. Nhƣng đặc điểm chung là đầu N của phân tử gắn với DNA, vùng trung tâm kích hoạt phiên mã. Hầu hết các protein MYB ở thực vật thuộc họ R2R3, và C1 (nhân tố điều hòa tổng hợp anthocyanin trong cây ngô). Trong đó, gen C1 là một trong những mục tiêu của gen nhảy. Khi có yếu tố di truyền vận động xen vào sẽ làm mất màu của nội nhũ [56]. Ở thực vật có mạch, nhân tố MYB/SANT thƣờng tƣơng tác với thành viên của họ bHLH điều hòa sinh tổng hợp phenylpropanoid và anthocyanin [55].
Nhóm bHLH có hơn 350 loại protein từ các nguồn khác nhau. Cấu trúc không gian của các TFs thuộc nhóm này có đặc điểm đặc trƣng với hai vòng xoắn α đƣợc nối với nhau bởi một vòng lặp (bHLH). Các thành viên của họ này có hai vùng bảo thủ với 60 axit amin. Tính linh hoạt của vòng lặp cho phép sự “dimer” hóa xảy ra bằng cách gấp và úp vòng xoắn bé hơn lên vòng xoắn còn lại. Đầu N của phân tử protein thƣờng có vòng xoắn lớn hơn và là vùng gắn với
DNA. Protein bHLH thƣờng liên kết với một trình tự bảo thủ E- box là CAYRMK, trong đó Y có thể là C hay T, R có thể là A hay G, M có thể là A hay C, và K có thể là G hay T. E- box khác nhau ở các phân họ khác nhau [69]. Đầu C có nhiệm vụ liên kết với các protein khác tạo thành homodimer và phức heterodimer. Vị trí của bHLH ở đầu C đƣợc xếp vào phân nhóm protein MYC, ở đầu N đƣợc xếp vào phân nhóm Sim, và ở giữa là phân nhóm MyoD [118].
Nhân tố phiên mã họ bHLH tham gia điều chỉnh chu kì tế bào, hệ tuần hoàn, tạo máu, duy trì tế bào gốc, phát triển cơ xƣơng và tế bào thần kinh và tạo phôi [93]. Ở thực vật, các protein MYB và MYC là hai trong các họ TFs tham gia vào quá trình chống chịu hạn của tế bào. Các gen thuộc họ MYB điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin ở ngô đã đƣợc nghiên cứu nhiều gồm các gen C1 (colorless1), P1 (Pericarp color1), và Pl (purple leaf). Trong khi các gen thuộc họ MYC đƣợc nghiên cứu gồm B (booster), R (red), Sn và Lc (Leaf color). Các trình tự gen này trong một họ khá tƣơng đồng với nhau [140]. Sự biểu hiện đồng thời của hai gen C1 và Lc của ngô ở khoai tây làm tăng hàm lƣợng anthocyanin, trong đó promoter E8 điều khiển gen Lc, E8 hoặc 35S điều khiển gen C1 [40].
Sản phẩm gen Lc là một loại protein điều hòa các enzyme chuyển hóa tạo ra anthocyanin có màu đỏ trong các mô gân lá, lƣỡi bẹ, vỏ hạt, lá bắc, mày ngô. Gen Lc có thể hoạt động độc lập hoặc tƣơng tác với gen C1. Chiều dài đầy đủ của gen Lc mã hóa cho 610 axit amin [61]. Sự gia tăng hàm lƣợng anthocyanin đã đƣợc ghi nhận thông qua sự biểu hiện vƣợt ngƣỡng của gen mã hóa các nhân tố phiên mã Lc ở ngô. Gen Lc sẽ làm tăng lƣợng mRNA của các gen PAL, CHS, F3H, DFR, LAR, ANS và ANR [143], [163].
Có 3 gen điều hòa tổng hợp anthocyanin của ngô (Lc, B-Peru, và C1) đƣợc chuyển vào cây linh lăng (Medicago sativa) nhằm thay đổi thành phần flavonoid trong thức ăn cho vật nuôi. Trình tự đầy đủ gen Lc với vùng không phiên mã ngắn ở đầu 5‟ đã đƣợc chuyển. Kết quả cho thấy mRNA của gen Lc đƣợc biểu
hiện cao ở lá cây và cho màu đỏ tía trong điều kiện xử lý chiếu sáng và nhiệt độ thấp. Sản phẩm biểu hiện gen của Lc làm tăng sự biểu hiện của gen cấu trúc
CHS và F3H, DFR trong lá cây chuyển gen. Ngoài ra, gen Lc cũng hoạt hóa gen mã hóa Leucocyanidin reductase tham gia tổng hợp tiền chất anthocyanidin. Trong khi đó, cây đƣợc chuyển gen B- Peru và C1 không quan sát rõ trên kiểu hình nhƣ đối với gen Lc [143], [163].
Anthocyanin có mặt ở hầu hết các bộ phận của nhiều loài thực vật khác nhau, đặc biệt trong rau, củ và quả. Do vậy, anthocyanin là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con ngƣời và mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe. Nghiên cứu về chất chỉ thị anthocyanin, ngƣời ta thấy rằng khi thực vật bị hạn, hàm lƣợng chất này trong tế bào đƣợc tăng cƣờng tổng hợp, làm thay đổi màu sắc của thân và lá, làm tăng tính chống chịu hạn của cây. Đây là kết quả tác động của các protein và enzyme do các gen mã hóa liên quan. Việc nghiên cứu cơ chế điều hòa và điều khiển quá trình này nhằm tạo ra nguồn lƣơng thực, thực phẩm giàu anthocyanin hay chọn tạo những giống cây có khả năng chống chịu hạn có giá trị thực tiễn rất cao. Tuy nhiên, hƣớng nghiên cứu này còn mới mẻ, đặc biệt đối với các giống ngô nếp địa phƣơng ở Việt Nam.
1.4. Ứng dụng real- time PCR nghiên cứu mức độ biểu hiện gen tham gia sinh tổng hợp anthocyanin
Real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích in vitro mà kết quả khuếch đại đƣợc hiện thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đó ngƣời làm thí nghiệm không phải làm tiếp các thí nghiệm đọc và phân tích kết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không, nên đƣợc gọi là real- time [23].
Kỹ thuật real-time PCR thƣờng đƣợc sử dụng để xác định mức độ phiên mã của một gen cấu trúc. Có hai loại real-time: (1) Real-time polymerase chain reaction (hay quantitative polymerase chain reaction, qPCR) dùng trong định lƣợng tác nhân đích là DNA; (2) RT-PCR/ qPCR combined technique (hay real-
time RT-PCR, thƣờng viết tắt là RRT-PCR hoặc qRT-PCR) dùng trong định lƣợng tác nhân đích là RNA, cDNA, DNA; phƣơng pháp này cần tiến hành qua bƣớc trung gian tổng hợp cDNA từ RNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc [155], [167]. Phƣơng pháp real- time PCR đang là lựa chọn tối ƣu để phát hiện, xác định số lƣợng và nghiên cứu quần thể vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và quy trình chế biến theo hƣớng dẫn chuẩn của ISO (ISO 22174: 2005, ISO/TS 20836: 2005, ISO 20837: 2006, ISO 20838: 2006) [112]. Trong khi real- time RT- PCR chỉ mới bắt đầu đƣợc áp dụng và có bƣớc triển vọng đột phá trong nghiên cứu bởi các phân tử RNA khó lƣu giữ đƣợc trong thời gian dài nhƣ DNA [44], [138].
Máy real-time PCR có buồng ủ nhiệt chạy đƣợc chƣơng trình luân nhiệt nhƣ máy PCR bình thƣờng, nhƣng có thêm một thiết bị real-time. Đây là thiết bị quang học có hai chức năng: (1) Có các nguồn sáng phát ra các tia sáng kích thích có bƣớc sóng xác định lên các ống phản ứng; (2) Có camera hay cảm biến quang ghi nhận ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng.
Hình 1.6. Cơ chế hoạt động của SYBR I (1- Khi chưa có sản phẩm khuếch đại; 2- Có sự hiện diện của phẩm khuếch đại)
Chìa khóa chính của phản ứng real-time PCR là chất huỳnh quang đƣợc thêm vào PCR mix. Chất này chèn vào sợi đôi của sản phẩm khuếch đại từ DNA đích và phát đƣợc ánh sáng huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích.
Hiện nay có một số chất huỳnh quang thông dụng nhƣ: màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA (SYBR green I, fluorescent, ROX); mẫu dò (mẫu dò lai, mẫu dò thủy giải hay TaqMan probe, mẫu dò “kẹp tóc”). Kỹ thuật real- time PCR sử dụng mẫu dò là những oligonucleotit sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích và phát huỳnh quang nếu nhận đƣợc nguồn sáng kích thích, có tính đặc hiệu rất cao nên thƣờng đƣợc ứng dụng để xác định genotype hay sự khác biệt một nucleotit của tác nhân đích [30]. Mặc dù một số nghiên cứu cho rằng độ nhạy của mẫu dò TaqMan cao gấp 10 lần SYBR green [59], [74], [126], nhƣng SYBR green ít chi phí hơn, đƣợc áp dụng cho nhiều trƣờng hợp, và đã có một số ví dụ chứng minh độ nhạy tốt hơn mẫu dò thủy giải [27], [113], [154].
Hình 1.7. Biểu đồ chảy (a) đƣợc hiển thị trên máy trong suốt chƣơng trình luân nhiệt melt- curve; Biểu đồ đỉnh chảy (b) xác định chính xác Tm của
các mẫu nhờ các đỉnh biểu đồ chảy của từng ống phản ứng
Đối với màu huỳnh quang, SYBR green I đƣợc lựa chọn vì các ƣu điểm vƣợt trội nhƣ màu huỳnh quang nền rất thấp, khả năng chèn vào sợi đôi cao, không làm sợi đôi bị gắn chặt vào nhau khi biến tính, ít ảnh hƣởng lên hiệu quả PCR. Việc thiết kế mồi cho phản ứng real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn giống nhƣ thiết kế mồi cho PCR thông thƣờng. Tuy nhiên, SYBR green I là màu chèn cho bất cứ DNA sợi đôi nào xuất hiện trong ống phản ứng sau các
ngƣời làm thí nghiệm phải cho máy chạy thêm chƣơng trình phân tích nhiệt độ nóng chảy Tm, gọi là chương trình melt- curve, để khẳng định tính đặc hiệu của phản ứng. Ngoài ra, SYBR green I không đƣợc ứng dụng trong multiplex real- time PCR để phát hiện các SNP hay định đƣợc genotype. Để khắc phục nhƣợc điểm này, ngƣời nghiên cứu sử dụng các màu HRM (high resolution melting dye) gồm: SYTQ9 green, LCGreen, EVAGreen, BEBO, BOXTO [23]. Theo Wong và Medrano (2005), kỹ thuật real-time PCR có độ nhạy gấp 10000 đến 100000 lần so với “RNase protection assays” [175], gấp 1000 lần so với lai dot blot [107], và có thể xác định chính xác một bản sao đơn đặc hiệu [129]. Ngoài ra, đây là công cụ rất đáng tin cậy để định lƣợng sự biểu hiện của các gen [68], và có hệ số phƣơng sai thấp hơn các kỹ thuật phân tích khác (SYBR® Green 14,2%; TaqMan® 24%, band densitometry 44,9%, lai mẫu dò 45,1%) [149].
Định lƣợng tác nhân trong mẫu là ứng dụng mạnh nhất của phƣơng pháp này. Trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh, kỹ thuật real-time PCR đƣợc ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định lƣợng các tác nhân gây bệnh ở ngƣời nhƣ virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán và theo dõi hiệu quả điều trị. Nhiều bộ kit thƣơng mại hóa sử dụng mẫu dò thủy giải (Roche COBAS, Taqman HBV test, Taqman HCV test...), mẫu dò lai (Roche Diagnostics), mẫu dò dạng “kẹp tóc” [160]. Tùy theo mục đích, ngƣời nghiên cứu có thể định lƣợng tuyệt đối (xác định chính xác số bản sao của tác nhân đích có trong mẫu thử) hay tƣơng đối (xác định mức độ bệnh hay mức độ biểu hiện gen) tác nhân đích [54], [152].
Những năm trở lại đây, kỹ thuật real-time PCR đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu mức độ nhiễm bệnh của thủy hải sản đối với các tác nhân virus hay vi khuẩn. Định lƣợng tƣơng đối cũng đƣợc sử dụng để định lƣợng mức độ biểu hiện của một gen hay sản phẩm biến đổi gen có trong mẫu. Phƣơng pháp này đánh giá thành công mức độ an toàn của sản phẩm và tỷ lệ biến đổi gen ở đậu, bắp, lúa mì, lúa, bông, súp lơ… [46]. Một hƣớng ứng dụng khác của kỹ thuật
real- time PCR là phát hiện sản phẩm khuếch đại của các trình tự DNA có thể sai khác chỉ một hoặc một vài nucleotit. Phát hiện các khác biệt này rất có ý nghĩa, ví dụ nhƣ phát hiện các đột biến kháng thuốc, phân biệt các kiểu di truyền của các bệnh phẩm khác nhau [105].
Hiện nay, kỹ thuật real- time PCR đang bắt đầu đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu mức độ biểu hiện các gen tham gia sinh tổng hợp sắc tố anthocyanin. Ramzzotti và cộng sự (2008) phân tích kết quả real-time PCR của gen UFGT cao nhất ở giống nho đỏ tím, hồng, hồng xanh và rất thấp ở nho xanh. Kết quả này tƣơng quan thuận với hàm lƣợng anthocyanin. Nguyên nhân là do gen UFGT
không đƣợc biểu hiện mặc dù thực tế là vẫn có một bản sao hoàn chỉnh. Những kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả góp phần khẳng định thêm rằng hệ thống điều khiển sinh tổng hợp anthocyanin ở cây nho mạnh hơn so với các loài khác nhƣ ngô và Arabidopsis [142]. Kết quả real- time PCR của Alsane và cộng sự (2011) khẳng định ba gen DFR, F3’H và F3’5’H biểu hiện rất cao khi xử lý hạn sinh lý bởi sucrose [28].
Paolocci và cộng sự (2007) sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR để phân tích mức độ biểu hiện của gen LAR1, LAR2 và ANR liên quan đến tổng hợp proanthocyanidin trong các mô khác nhau ở cây sen thay cho lai Northern blot. Bởi với kỹ thuật lai này không thu đƣợc kết quả khi mức độ biểu hiện của gen ở mức độ thấp và rất thấp. Các tác giả đƣa ra kết luận rằng sự hoạt động của gen
ANR và LAR cần sự điều hòa bởi một nhân tố phiên mã thuộc họ bHLH [130]. Với mục đích đánh giá ảnh hƣởng của mức độ phiên mã cao gen NtAn2
(một thành viên của họ R2R3 MYB) đƣợc tách từ cây thuốc lá đến các gen cấu trúc trong con đƣờng anthocyanin ở cây Arabidopsis chuyển gen, kết quả real- time RT- PCR cho thấy các gen PAL và 4CL trong các dòng cây chuyển gen