5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.2.1.3. Hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của oxy hóa
Phản ứng của cây trồng còn biểu hiện nhƣ đóng khí khổng để ozon không xâm nhập đƣợc vào mô lá đồng thời hoạt hoá các hệ chống ôxy hoá. Hệ thống bảo vệ cây trồng bao gồm các enzyme và hợp chất không phải enzyme. Những hợp chất đó là:
Superoxide dismutase - SOD: H2O, O2 là những yếu tố cần thiết để duy trì sự sống trong cơ thể. Nhƣng dƣới sự tác động của môi trƣờng bất lợi, trong các hệ thống chuyển năng lƣợng và electron của tế bào thƣờng tạo ra các gốc tự do. Sự có mặt của SOD sẽ xúc tác phản ứng loại bỏ superoxide [115].
Catalasse là enzyme có chứa nhân hem, xúc tác cho phản ứng chuyển hoá H2O2 thành H2O và O2. Tất cả các isozym của enzyme này đều là tetramer có MW= 220000Da. Sự đa dạng của enzyme cũng đƣợc nêu lên trong nhiều loại thực vật khác nhau [115]. Ví dụ: catalase từ ngô có 3 isozym cat-1, cat-2, cat-3. Gen mã hoá cho chúng nằm trên các vị trí khác nhau nhiễm sắc thể và không phụ thuộc vào nhau. Cat-1 và cat-2 có trong peroxisome và dịch tế bào, cat-3 thấy trong ty thể [153].
Các enzyme chuyển hoá ascorbate: ascorbate loại bỏ gốc tự do theo các hƣớng khác nhau. Trong lục lạp, H2O2 chuyển hoá thành H2O dƣới tác dụng của ascorbate peroxidase, ascorbate tạo ra monodehydroascorbate radical. Chất này chuyển hoá về ascorbate nhờ monodehydroascorbate reductase và năng lƣợng của NADP. Bằng cách khác, monodehydroascorbate radical chuyển hoá thành dehydroascorbate, chất này dƣới tác dụng của dehydroascorbate reductase phản ứng với glutathion tạo thành ascorbate và oxidized glutathione (GSSG). GSSG chuyển về dạng GSH nhờ glutathione reductase và năng lƣợng của NADP [115].
Glutathion (GSH) là tripeptid (Glu-Cys-Gly), tính chống oxi hóa nhờ gốc SH của Cys. Một số legume có chứa một dạng đồng dạng khác: Glu-Cys-Ala. GSH thực hiện chức năng bằng nhiều cách: phản ứng thẳng với oxygen, superoxide, hydroxyl radical, loại bỏ các dạng acyl peroxide đƣợc hình thành khi lipit bị oxy hóa bởi peroxide [128].
Glutathion reductase (GR) khử GSSG thành GSH. Đây là enzyme tƣơng đối bảo thủ. Nếu nhƣ ở động vật chỉ có một dạng, thì ở thực vật phát hiện ra nhiều isozym trên điện di hai chiều và có thể là sản phẩm của các gen khác nhau. GR có trong lục lạp, nhƣng hoạt tính cao ở trong dịch tế bào, ở trong ty thể ít hơn [115].
Ngoài các hợp chất có bản chất enzyme trên, các chất khác không có hoạt tính xúc tác sinh học cũng tham gia trực tiếp chuyển hóa các gốc tự do nhƣ: vitamin E, vitamin C, carotenoid, polyamin, zeaxanthin và flavonoid. Chúng tƣơng tác với các gốc carbocyl tự do, hạn chế sự chuyển hóa thành các gốc tự do khác. Carotenoid và flavonoid còn nhận năng lƣợng ánh sáng, hạn chế tác động của ánh sáng và các gốc tự do sinh ra trong quá trình quang hợp.
1.2.2. Cơ sở sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở ngô
1.2.2.1. Cơ sở hình thái, sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn
Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật rất phức tạp liên quan đến các đặc điểm hình thái giải phẫu, sinh lí, hoá sinh, và liên quan đến các gen chịu hạn. Hiện nay có nhiều quan điểm khác nhau giải thích cơ chế chịu hạn, trong đó có hai quan điểm đƣợc chấp nhận hơn cả là vai trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu.
Bộ rễ có hình thái khoẻ, dài, mập, có sức xuyên sâu cho cây hút đƣợc nƣớc ở những vùng sâu, vùng xa [29]. Môi trƣờng hạn gây ra các biểu hiện thích ứng tại vùng xảy ra yếu tố cực đoan và ở mức độ cao hơn sẽ biểu hiện toàn bộ cơ
thể. Trong trƣờng hợp có mặt axit abscisis quá trình đóng mở lỗ khí đƣợc điều chỉnh làm hạn chế sự thoát hơi nƣớc [172].
Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nƣớc của tế bào rễ cây đối với đất. Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu đƣợc các phân tử nƣớc hiếm hoi có trong đất nhờ vậy cây ngô có thể vƣợt qua tình trạng hạn cục bộ [120]. Khi tế bào mất nƣớc, các chất hoà tan sẽ đƣợc tích luỹ nhằm chống lại việc giảm mất nƣớc, tăng khả năng giữ nƣớc của nguyên sinh chất và chúng có thể thay vị trí nƣớc nơi xảy ra các phản ứng sinh hoá, tƣơng tác với lipit hoặc protein trong màng ngăn chặn sự phá huỷ của màng và các phức protein. Các chất hoà tan có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao bao gồm các ion K+, proline, axit hữu cơ, các loại đƣờng. Khi bắt đầu mất nƣớc, hàm lƣợng proline và ABA tăng, tăng tổng hợp protein, nhƣng nếu hạn kéo dài sẽ xảy ra hiện tƣợng thuỷ phân protein [147], [161]. Quá trình thuỷ phân các hydratcacbon dự trữ cũng là nguồn cung cấp chất tan cho quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu [184].
Hạn là yếu tố phổ biến làm giảm năng suất cây trồng nói chung. Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về tính chịu hạn của cây ngô. Tính chịu hạn của cây ngô có liên quan tới sự sinh trƣởng và phát triển của bộ rễ. Trong môi trƣờng bị hạn rễ thƣờng phát triển theo chiều sâu và số lƣợng rễ tăng lên [84]. Việc đánh giá các giống thí nghiệm trong điều kiện khô hạn trên đồng ruộng cho thấy những giống có khối lƣợng rễ lớn thì có khả năng chịu hạn tốt hơn.
Tốc độ vƣơn dài của lá phụ thuộc vào sự thay đổi về thế nƣớc của lá và khả năng cung cấp nƣớc của đất. Đây cũng là một chỉ tiêu để đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô. Ở điều kiện bình thƣờng, cây thực hiện các chức năng sống của mình thông qua các quá trình sinh lí và sinh hoá. Khi gặp điều kiện khô hạn hoặc nhiệt độ cao, các tính chất lí hoá của keo nguyên sinh thay đổi ví dụ nhƣ:
tính đàn hồi và độ nhớt bị giảm, đồng thời trao đổi chất cũng giảm, tế bào bị mất nƣớc. Kết quả tế bào sẽ bị chết do mất tính bán thấm, không có hiện tƣợng co nguyên sinh chất [10]. Đặc điểm này là cơ sở xây dựng các phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng của cây: phân tích protein, axit amin, ABA...
Axit abscicis có vai trò quan trọng đối với khả năng chịu hạn ở ngô. Kết quả nghiên cứu của các tác giả Hu và cộng sự (2012), Jiang và cộng sự (2013) chứng minh vai trò trung tâm trong việc điều khiển sự đóng mở khí khổng duy trì cân bằng nƣớc của cây ngô bị hạn. Sự xuất hiện ABA trong điều kiện hạn có liên quan đến các gen đặc hiệu [80], [85].
Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính rất quan trọng của tế bào khi bị mất nƣớc do lạnh, muối hoặc nóng hạn. Những thực vật tồn tại trên môi trƣờng mất cân bằng về áp suất thẩm thấu đòi hỏi phải có khả năng chống lại đƣợc điều kiện khắc nghiệt đó. Tồn tại 2 cơ chế khắc phục sự bất lợi này: (1) Khả năng thích nghi đặc biệt của cấu trúc và hình thái rễ, lá để tránh cho tế bào khỏi mất nƣớc; (2) Khả năng chịu mất nƣớc dựa trên sự thay đổi tinh vi trong sinh hoá tế bào dẫn đến sự xuất hiện và tích lũy các chất hoà tan, protein, axit amin đặc hiệu.
Proline có vai trò rất quan trọng trong quá trình điều hoà áp suất thẩm thấu trong tế bào, đồng thời nó còn là một axit amin ƣa nƣớc có khả năng giữ và lấy nƣớc cho tế bào, ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+, tƣơng tác với protein màng và lipit màng, ngăn chặn sự phá huỷ của màng và các phức protein khác [106]. Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy khi cây trồng gặp hạn, cây giảm tổng hợp protein và tăng tổng hợp proline. Sự thay đổi về một số axit amin, đặc biệt là proline có liên quan đến tính chịu hạn của ngô. Kết quả nghiên cứu của Yamada và cộng sự (2005) cho thấy hàm lƣợng proline tăng lên ở điều kiện mất nƣớc cực đoan [177].
tƣơng tác với màng tế bào, hình thành cầu nối hydro giữa gốc hydroxyl của sucrose với nhóm phospholipit. Bằng cách này chúng thay thế vị trí nƣớc trong màng tế bào. Sự có mặt của chúng trong nguyên sinh chất còn có khả năng bảo vệ các phức enzyme khác. Chức năng chính của chúng là ngăn chặn sự thay đổi và tăng cƣờng áp suất thẩm thấu, ổn định pH cho tế bào [154].
Fructant là phân tử polyfructose có ở nhiều loại thực vật. Chúng đƣợc tổng hợp từ sucrose và trữ trong các không bào ở dạng hòa tan. Những giống có tích luỹ fructant cao đều có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu khi gặp điều kiện cực đoan nhƣ hạn và lạnh. Đó chính là khả năng chuyển hoá một cách nhanh chóng fructant thành các sản phẩm có độ polimer hoá thấp hơn. Mức độ polimer hoá trung bình của fructant suy yếu dần với sự mất nƣớc và giảm nhiệt độ [63].
1.2.2.2. Cơ sở sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô
Tính chịu nóng hạn của cây trồng đƣợc hình thành trong quá trình tiến hoá tự nhiên, do một hệ đa gen quyết định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây [41]. Kết quả phân tích microarray ở đối tƣợng Arabidopsis
khi sử dụng 1300 cDNA cho thấy có khoảng 44 gen. Ngày nay vẫn chƣa tìm đƣợc gen thực sự quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu hạn [150]. Các gen chịu hạn của những cây hạn sinh lý vẫn là vấn đề nghiên cứu lý thú đối với các nhà khoa học.
Yếu tố ARE (Antioxidant Responsive Element) có trong vùng promoter của các gen glutathion stransferase, Mn- Superoxide dismutase (Mn-SOD). Vai trò của ARE là kích hoạt các gen này biểu hiện thành sản phẩm protein trong điều kiện cực đoan oxy hoá. Những yếu tố này cũng tìm thấy trong vùng promoter của các gen chống oxy hoá ở thực vật (cat của ngô). Vai trò của các yếu tố này là hoạt hoá các gen chống oxy hoá và các gen chống chịu trong các điều kiện hạn, lạnh... Vùng promoter của 3 gen cat đƣợc nghiên cứu rất kỹ. Chúng có những yếu tố hoạt hóa phiên mã nhƣ ARE, AP-1, NF- KB [153].
Hiện nay các nhà khoa học đã phân lập đƣợc 30 gen khác nhau thuộc thành viên của nhóm dehydrin ở những cây trồng khác nhau. Một số gen mã hoá protein dehydrin ở ngô (chủ yếu là giống ngô lai) đã đƣợc công bố trên ngân hàng trình tự gen quốc tế. Nghiên cứu về gen dehydrin dhn1 ở 2 giống ngô chịu hạn (DF1 và DF2) từ DNA hệ gen của Trần Thị Phƣơng Liên (2005) cho thấy gen này có trình tự 628bp, trình tự axit amin suy diễn dài 169 axit amin có cấu trúc Y2SK2 [9].
Một trong những cơ chế để nâng cao khả năng chịu hạn và chịu muối là điều chỉnh áp suất thẩm thấu và loại bỏ các gốc tự do. Những thử nghiệm đầu tiên về hƣớng này đã đƣợc thực hiện. Nguyễn Thị Thuý Hƣờng (2011) đã chuyển gen P5CS mã hóa enzyme tham gia tổng hợp proline vào cây thuốc lá. Sau khi gây hạn nhân tạo, hàm lƣợng proline tăng rất mạnh so với trƣớc gây hạn ở tất cả các dòng cây nghiên cứu, đặc biệt các dòng cây chuyển gen. Sau 9 ngày gây hạn, proline ở cây đối chứng không chuyển gen tăng 206,8 %, trong khi ở cây chuyển gen tăng từ 259,5- 451,8% [8].
Hƣớng tiếp theo để nghiên cứu sử dụng công nghệ gen tăng cƣờng tính chống chịu sẽ là: điều khiển sự biểu hiện và hoạt tính của các hệ vận chuyển K+ (qua hoạt tính của protein tạo kênh chuyển- aquaporin); tăng cƣờng sự thoát các ion Na+ của tế bào rễ, tonoplast; tăng cƣờng điều chỉnh áp suất thẩm thấu; tăng cƣờng cơ chế bảo vệ tế bào bằng các phản ứng trao đổi chất đặc hiệu trong tế bào nhờ có protease, protein sốc nhiệt, loại bỏ các gốc tự do... [10]
Nghiên cứu cơ sở phân tử của tính chống chịu theo hƣớng khả năng bảo vệ của tế bào khỏi tác động của điều kiện cực đoan là nghiên cứu vai trò của nhóm protein sốc nhiệt, trong đó có các chất MGPT- Moleculer chaperone, ubiquitin, protease, amylase, protein LEA...
Nhóm 1: nhóm có chức năng chịu hạn bao gồm MGPT, protein LEA, protein kênh chuyển nƣớc qua màng, đƣờng, proline, transporters detoxification
enzyme, protein antifreeze,... Protein LEA, MGPT và mRNA binding protein đã đƣợc nghiên cứu về mặt hóa sinh, và chỉ ra rằng chúng tham gia bảo vệ các cấu trúc đại phân tử nhƣ các enzyme, lipit và mRNA khỏi bị mất nƣớc. Proline, glycine, betaine và đƣờng thực hiện chức năng nhƣ các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu [41], [191].
Nhóm 2: các protein có chức năng điều khiển sự biểu hiện gen và có thể có chức năng trong việc phản ứng đối với tình trạng hạn nhƣ protein kinase, nhân tố phiên mã và các enzyme trong chuyển hoá phospholipit. Gen mã hoá cho nhân tố phiên mã có chứa DNA binding motif. Chúng có vai trò điều hoà các gen chức năng dƣới tác động của điều kiện cực đoan. Protein kinase hoặc phosphatase có thể tham gia cải biến (hoặc sửa đổi) những protein chức năng hoặc protein điều hoà tham gia vào chu trình truyền tín hiệu khi gặp điều kiện cực đoan[88].
Theo Boston (1996), chức năng chính của MGPT ở thực vật là: tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein mới tổng hợp từ bƣớc đầu tiên đến cuối cùng; duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein; ngăn chặn sự huỷ hoại protein chƣa tạo cấu trúc đúng; khởi đầu cho sự phân huỷ protein bị biến tính. Nhƣ vậy MGPT có chức năng rất quan trọng khi các tế bào gặp điều kiện cực đoan, nhất là sốc nhiệt [90].
Protein LEA đóng vai trò quan trọng trong sự chịu khô hạn của hạt. Protein LEA rất khác nhau giữa cây Một lá mầm và Hai lá mầm. Chúng thay thế vị trí nƣớc trong tế bào, và thực hiện các chức năng nhƣ: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, huỷ protein biến tính, điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Protein LEA có trong dịch bào, ty thể, không bào, lục lạp, và vùng lân cận màng tế bào. Các nhà khoa học nhận thấy rằng một số intron nhất định trong gen có thể thúc đẩy sự biểu hiện gen ở cây tăng lên nhiều lần, đặc biệt đƣợc nghiên cứu kỹ ở ngô [10]. Protein LEA đƣợc chia thành các nhóm: 1- D19, 2- D11, 3-D7, 4- D113, 5-
D29, 6- D95 [191].
Phần lớn các gen chịu cảm ứng điều hiện khô hạn đều cảm ứng với điều kiện mặn. Một trong số gen này còn chịu cảm ứng điều kiện lạnh, phụ thuộc vào phản ứng với ABA. Những đƣờng dẫn truyền tín hiệu này chia thành 2 loại: (1) Phụ thuộc vào ABA: đòi hỏi tổng hợp protein MYC, MYB hoặc không cần; (2) Không phụ thuộc vào ABA: yếu tố phản ứng với mất nƣớc DRE tham gia vào việc điều hòa biểu hiện gen.
DRE đƣợc đặt tên cho trình tự 9 bp TACCGACAT. Yếu tố protein gắn với trình tự DRE (DREBS) ở vùng promoter. Những protein này chứa các các vùng bảo thủ nhƣ các protein EREBP (tham gia biểu hiện ethylene responsive gene), AP2 (tham gia trong quá trình biểu hiện kiểu hình của thực vật có hoa). Các gen
rd19, rd21 mã hóa cho thiol protease; erd1 mã hóa cho tiểu phần điều hòa của protease CLP, là những gen chỉ cảm ứng bởi hạn, mà không cảm ứng bởi ABA hay điều kiện lạnh [10].
Từ những năm 90 của thế kỷ XX đến nay, đã có nhiều công trình trong nƣớc quan tâm nghiên cứu đến khả năng chịu hạn của cây ngô. Đó là các kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô trên đồng ruộng [18]; đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô non trong điều kiện hạn nhân tạo [13], [24]; phân lập gen dehydrin dhn1/rab17 từ DNA hệ gen [9]; nghiên cứu chọn tạo dòng thuần ngô bằng phƣơng pháp nuôi cấy hạt phấn [5], [21]; nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở ngô [19]... Hiện nay trên thế giới cũng đã và đang tiến hành một hƣớng nghiên cứu về sắc tố anthocyanin liên quan đến hạn ở một số đối tƣợng thực vật. Ở Việt Nam, còn ít công trình đề cập đến sắc tố chỉ thị này, đặc biệt đối với các giống ngô nếp địa phƣơng.