5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3.3.4. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5
Lấy 10l vector tái tổ hợp cho vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Đặt hỗn hợp trong đá 20 phút, sau đó ủ ở 42oC đúng 1 phút 30 giây và ủ trong đá 5 phút. Bổ sung 200 l LB lỏng, nuôi lắc hỗn hợp (200 vòng/phút) ở 37oC trong 1 giờ. Lấy sản phẩm ra cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có kháng sinh carbenicillin (50mg/l), IPTG (0,1 mM) và X-gal (40 mg/l). Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trƣờng LB lỏng qua đêm (có bổ sung carbenicillin).
2.3.3.5.Kiểm tra sản phẩm tách dòng
Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm tách dòng bằng phản ứng clony- PCR với cặp mồi LcF1 và LcR1, BF1 và BR1. Phản ứng clony- PCR đƣợc thực hiện theo quy trình ở mục 2.3.3.2.
2.3.3.6.Tách plasmid
Sau khi kiểm tra sản phẩm tách dòng tiến hành tách plasmid bằng dung dịch sol I, sol II, sol II (Bảng 2.3). Các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Bƣớc 1: Chuyển 2ml dịch nuôi sang ống eppendorf. Ly tâm 6000 v/p ở 4o
C trong 5 phút. Loại bỏ dịch môi trƣờng để thu nhận cặn tế bào.
Bƣớc 2: Làm tan cặn tế bào trong 100l dung dịch Sol I (giữ trong đá),
Bƣớc 3: Bổ sung 200l dung dịch Sol II vào mỗi eppendorf. Đậy nắp chặt, đảo ngƣợc eppendorf vài lần và giữ trên đá trong 1 phút
Bƣớc 4: Bổ sung 150l dung dịch Sol III. Đậy nắp chặt, đảo ngƣợc eppendorf vài lần và giữ trong đá trong 3-5 phút.
Bƣớc 5: Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC và hút chuyển dịch phía trên sang ống mới. Bổ sung hỗn hợp chloroform: isoamin (24:1) theo tỉ lệ 1:1, đảo đều mẫu sau đó để ở nhiệt độ phòng 15 phút.
Bƣớc 6: Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC và hút dịch phía trên chuyển sang ống mới.
Bƣớc 7: Tủa plasmid bằng cách bổ sung 1 lần thể tích isopropanol lạnh và giữ ở -20oC trong 30 phút.
Bƣớc 8: Thu tủa bằng cách ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4o
C. Rửa sạch mẫu bằng cách bổ sung 0,5ml ethanol 70độ. Ly tâm thu tủa 12000v/p
trong 10 phút ở 4o
C (lặp lại 2 lần).
Bƣớc 10: Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 2 phút hoặc để mở nắp trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trong box bật quạt.
Bƣớc 11: Hoà tan tủa plasmid trong 50l H2O khử vô trùng chứa 20g/ml RNase. Mẫu đƣợc lƣu giữ ở -20 oC.
Bƣớc 12: Kiểm tra DNA plasmid bằng điện di trên gel agarose 1,0 %.
Các mẫu plasmid tách từ các dòng tế bào đã chọn lọc đƣợc kiểm tra lần thứ hai bằng enzyme BamHI và dung dịch đệm Tango để xác định sự có mặt của sản phẩm PCR đoạn gen Lc và B gắn vào. Thời gian thực hiện phản ứng cắt kéo dài trong 3 giờ ở 37oC. Sản phẩm phản ứng cắt đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch tách plasmid Dung dịch Hóa chất Nồng độ Thể tích Dung dịch I (Sol I) (khử trùng, giữ 4oC) Tris- HCl, 1M, pH 8,0 25 mM 2,5 ml EDTA, 0,5M, pH 8,0 10 mM 2 ml Glucose 50 mM 0,9 g
Dung dịch II (Sol II)
(Pha mới trƣớc khi sử dụng)
NaOH, 2N 0,2 N 10 ml
SDS, 10% 1% 10 ml
Dung dịch III (Sol III) (giữ 4oC)
CH3COOK, pH 5,5 5,0 M 60 ml
CH3COOH 11,5% 11,5 ml
H2O 28,5 ml
(Tổng thể tích mỗi loại Sol, V= 100 ml)
2.3.3.7.Xác định trình tự gen
Xác định trình tƣ̣ DNA theo phƣơng pháp của Sanger và phân tích trên máy tƣ̣ đô ̣ng ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analizer.
2.3.3.8.Phương pháp real- time PCR
Mức độ phiên mã của gen B và Lc đƣợc xác định bằng phản ứng real- time RT- PCR với chất màu gắn huỳnh quang SYBR Green I của hãng Roche và house- keeping gene Actin. Bƣớc đầu tiên của kỹ thuật này là tổng hợp cDNA từ các mẫu RNA tách đƣợc bằng phản ứng RT (thực hiện theo mục 2.3.3.2). Các cặp mồi sử dụng trong real- time RT- PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự cDNA đã phân lập đƣợc và đƣợc tổng hợp tại hãng Invitrogen có trình tự nhƣ sau:
LcF2: 5‟- CGAAACGATAGCCTACCTCAAG - 3‟ LcR2: 5‟- GCACGTCCTTGTCCGAG - 3‟
BF2: 5‟- GTCCATTTCAAGCACTCAACG - 3‟ BR2: 5‟- GTAGGTCATGCAGATCACGTAG- 3‟
ActF: 5‟- AAGTACCCGATTGAGCATGG - 3‟ ActR: 5‟- TCATAGATTGGAACCGTGTGG - 3‟ Bảng 2.4. Thành phần phản ứng real- time RT- PCR Thành phần Nồng độ Thể tích (l) Master mix 2 X 12,5 Primer F 10 pmol/l 0,5 Primer R 10 pmol/l 0,5 cDNA 500 ng/l 2 Nƣớc cất 4,5
Sản phẩm dự kiến của đoạn gen đích Lc có kích thƣớc 270bp, đoạn gen B
có kích thƣớc 262bp,đoạn gen Actin có kích thƣớc 257bp.
Phƣơng pháp tính: Dựa vào phƣơng pháp 2-Ct
của Livak [182]: kết quả định lƣợng cho gen đích (Tg, target gene) và gen tham chiếu (Ref- reference gene, hay HK- housekeeping gene) đƣợc tính qua các thông số sau:
Ct[H/Tg]: là chu kỳ ngƣỡng của gen đích trong mẫu chịu hạn (H),
Ct[H/Ref]: là chu kỳ ngƣỡng của gen tham chiếu trong mẫu chịu hạn (H), Ct[ĐC/Tg]: là chu kỳ ngƣỡng của gen đích trong mẫu đối chứng (ĐC),
Ct[ĐC/Ref]: là chu kỳ ngƣỡng của gen tham chiếu trong mẫu đối chứng (ĐC). Chu kỳ ngƣỡng (Ct) của gen đích trong mẫu chịu hạn (H) và mẫu đối chứng (ĐC) đƣợc thƣờng hóa (normalized) bằng cách tính hiệu số chênh lệch Ct của gen đích với gen tham chiếu trên các mẫu :
Mẫu chịu hạn: ΔCt[H]= Ct[H/Tg] - Ct[H/Ref] Mẫu đối chứng: ΔCt[ĐC]= Ct[ĐC/Tg] - Ct[ĐC/Ref] Thƣờng hóa ΔCt mẫu thử: ΔΔCt= ΔCt[H] - ΔCt[ĐC]
Phản ứng đƣợc thực hiện trên máy real- time PCR của hãng Roche (LighCylce 480). Chu trình nhiệt trên máy nhƣ sau:
Nhiệt độ (°C) Thời gian (g:p:gi) Độ dốc (Slope,°C/s) Kiểu phân tích (Acquisition Mode/Analysis Mode
Biến tính: 1 chu kì 95 00:10:00 20 None
Khuếch đại 45 chu kì Quantification 95 00:00:10 20 None 58 00:00:10 20 None 72 00:00:20 20 Single Melting curves 1 chu kì Melting Curves 95 00:00:00 20 None 65 00:01:00 20 None 95 00:00:00 0,1 Continuous Cooling (1 chu kì) 40 00:00:30 20 None
2.3.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu thống kê đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình Excel theo Chu Hoàng Mậu (2008) [12].
Sử dụng phần mềm NTSYS version 2.02i để phân tích sự đa dạng và mối quan hệ giữa các giống ngô.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA 10 GIỐNG NGÔ NẾP ĐỊA PHƢƠNG PHƢƠNG
Kết quả sƣu tập 10 giống ngô nếp địa phƣơng đƣợc trình bày ở Bảng 1.1 và Bảng 1.2 (Phụ lục 1). Kết quả quan sát cho thấy cả 10 giống ngô đều có hạt màu trắng. Khi nghiên cứu về màu sắc hạt, các nhà khoa học khẳng định chính hàm lƣợng và số loại anthocyanin quyết định [109], [117]. Khối lƣợng 1000 hạt của 10 giống dao động từ 187,7(g) đến 250,6(g), giống BN có khối lƣợng lớn nhất, nhỏ nhất là giống BS1. Chiều cao cây của 10 giống là chiều cao đặc trƣng của giống ngô nếp địa phƣơng, dao động từ 116,90cm đến 195,10cm (Phụ lục 1). Các giống đều có màu sắc thân là màu xanh. Khi tiến hành gây hạn nhân tạo ở giai đoạn cây non 3 lá cho thấy, giống nào có khả năng chịu hạn cao thì thân và gân lá có màu đỏ- tía, phiến lá ngả màu vàng, đồng thời hàm lƣợng anthocyanin đo đƣợc cũng cao hơn so với các giống chịu hạn kém [109], [117]. Chất lƣợng hạt của 10 giống ngô đƣợc xác định thông qua hàm lƣợng protein (từ 6,88% đến 9,46%), lipit (từ 3,31% đến 5,00%) và đƣờng (từ 2,82% đến 2,52%) (Phụ lục 1).
3.1.1. Khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phƣơng giai đoạn hạt nảy mầm nảy mầm
3.1.1.1. Ảnh hưởng của hạn đến hàm lượng đường và hoạt độ - amylase
Amylase là enzyme phân giải tinh bột, phổ biến với hai loại - amylase và - amylase. Khi hạt nảy mầm, - amylase đƣợc tổng hợp và hoạt động mạnh làm cho hàm lƣợng đƣờng tăng, kéo theo sự gia tăng áp suất thẩm thấu, dẫn đến tăng khả năng chống lại sự mất nƣớc của ngô giai đoạn nảy mầm [79]. Việc khảo sát đặc điểm phản ứng kiểu gen ở giai đoạn hạt nảy mầm là một trong những cơ sở đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô. Vì vậy chúng tôi
tiến hành đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô thông qua sự thay đổi của hoạt độ - amylase và hàm lƣợng đƣờng trong điều kiện gây hạn sinh lý bằng cách bổ sung sorbitol 5% vào môi trƣờng nuôi cấy. Kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 2.1 (Phụ lục 2), Bảng 2.2 (Phụ lục 2) và Hình 3.1, Hình 3.2.
Hình 3.1. Biểu đồ mô tả sự biến động hoạt độ - amylase của các giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi sorbitol 5%
Bảng 2.1 (Phụ lục 2) và Hình 3.1 cho thấy có sự khác nhau về hoạt độ - amylase giữa các giống ngô và giữa các ngày tuổi mầm. Hoạt độ - amylase tăng từ giai đoạn 1 ngày tuổi, cao nhất là giai đoạn 7 ngày tuổi và giảm ở 9 ngày tuổi ở cả lô đối chứng và lô gây hạn. Ở 7 ngày tuổi, giống NH và Mo có hoạt độ - amylase cao nhất (tƣơng ứng 2,274 ĐVHĐ/mg và 2,233 ĐVHĐ/mg, tăng so đối chứng 156,16% và 156,78%), thấp nhất là giống BN, BS1, VK2,
ĐVHĐ/mg; tăng so đối chứng 136,34%, 121,91%, 136,34%, 116,93%). Thứ tự này thay đổi sau 9 ngày gây hạn, thứ tự giảm dần là BN> Mo> NH, DG2> TB> PT> ĐX2> KL> VK2> BS1. Hoạt độ - amylase khác nhau thể hiện mức phản ứng của kiểu gen các giống là khác nhau.
Khả năng chống chịu mất nƣớc của thực vật liên quan đến sự tích luỹ các chất hoà tan có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhƣ: proline, glucose, fructose, axit amin… trong đó hàm lƣợng đƣờng đƣợc tích luỹ có mối tƣơng quan thuận với hoạt độ của - amylase với hệ số tƣơng quan cao, từ 0,72 đến 0,91 (Bảng 2.2- Phụ lục 2).
Hình 3.2. Biểu đồ mô tả sự biến động hàm lƣợng đƣờng của các giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi sorbitol 5%
Kết quả ở Bảng 2.2 (Phụ lục 2) và Hình 3.2 cho thấy, hàm lƣợng đƣờng tan đều tăng từ giai đoạn hạt nảy mầm 1 ngày tuổi đến 7 ngày tuổi, và giảm ở 9
ngày tuổi. Sự biến đổi hàm lƣợng đƣờng của các giống là khác nhau. Ở 7 ngày tuổi hàm lƣợng đƣờng cao nhất ở giống NH và Mo (tƣơng ứng 3,099% và 3,092%, tăng so đối chứng 124,26% và 123,29%), thấp nhất là giống BS1, KL, VK2 (tƣơng ứng là 2,60%, 2,822%, 2,825%; tăng so đối chứng 120,55%, 121,0%, 121,25%). Sau 9 ngày bị hạn, thứ tự hàm lƣợng đƣờng tăng so đối chứng của các giống xếp theo thứ tự giảm dần là Mo> TB> ĐX2> NH> PT> KL> VK2> BN> DG2> BS1. Khi xử lý hạn sinh lý, cả hàm lƣợng đƣờng và hoạt độ amylase đều tăng lên so với đối chứng. Kết quả này chứng tỏ sorbitol đã ảnh hƣởng đến hàm lƣợng đƣờng và hoạt độ của - amylase.
3.1.2.2. Ảnh hưởng của hạn đến sự biến đổi của hoạt độ protease
Bảng 2.3 (Phụ lục 2) và Hình 3.3 cho thấy hoạt độ của protease của các giống ngô đều tăng dần và đạt cực đại vào ngày nảy mầm thứ 7, sau đó giảm xuống vào ngày thứ 9, kết quả này phù hợp với một số công trình đã công bố [6]. Ở 7 ngày tuổi, giống NH và Mo có hoạt độ của protease cao nhất (tƣơng ứng 2,144 ĐVHĐ/mg và 2,123 ĐVHĐ/mg, tăng so đối chứng 162,12% và 163,08%), thấp nhất là giống VK2, KL, BS1, BN (tƣơng ứng là 1,415 ĐVHĐ/mg, 1,419 ĐVHĐ/mg, 1,436 ĐVHĐ/mg, 1,445 ĐVHĐ/mg; tăng so đối chứng 139,58%, 138,83%, 139,47%, 167,06%). Sau 9 ngày bị hạn sinh lý, thứ tự hoạt độ của protease tăng so đối chứng của các giống xếp theo thứ tự giảm dần là VK2> ĐX2> KL> TB> Mo> NH> BS1> DG2> PT> BN.
Theo Vanacker và cộng sự (2006), quá trình oxy hóa và sự suy thoái protein sẽ tăng theo mức độ hạn. Các protein bị oxy hóa này nhanh chóng bị phân hủy bởi protease [169]. Sự khác biệt trong kháng hạn có thể là do sự khác biệt trong khả năng chống xâm thực chất gỗ giảm [103]. Điều này có thể làm tăng tính dễ tổn thƣơng của mô xylem, khi đó không khí choán đầy ống dẫn ngăn cản vận chuyển nƣớc [71]. Nghiên cứu của Chutipaijit và cộng sự (2008) cho rằng có sự khác biệt trong phản ứng sinh lý và sinh hóa khi xử lý
hạn sinh lý bởi 100mM manitol. Tất cả các cây mạ bị hạn đều có sự suy giảm sinh khối (FW và DW) và nồng độ sắc tố quang hợp trong khi mức độ peroxidase lipit tăng cao. Những kết quả thực nghiệm chứng minh rằng giống cây chịu hạn có hàm lƣợng lipit cao hơn hơn so với giống nhạy cảm với hạn [51]. Các kết quả nghiên cứu của Jain và cộng sự (2010) cho thấy tác dụng ức chế của sorbitol đối với sinh trƣởng và phát triển của ngô giai đoạn hạt nảy mầm: khả năng nảy mầm thấp; giảm chiều dài rễ và mầm, khả năng quang hợp; giảm các chỉ tiêu hóa sinh nhƣ hàm lƣợng diệp lục a và b, protein. Tuy nhiên hàm lƣợng proline và hoạt động khử nitrate tăng cùng với ROS [83].
Hình 3.3. Biểu đồ mô tả sự biến động hoạt độ protease của các giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi sorbitol 5%
3.1.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô giai đoạn cây non 3 lá
3.1.2.1. Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô khi bị hạn
Khả năng chịu hạn của cây ngô đƣợc biểu hiện rõ ở từng thời điểm, nhƣng có hai thời kỳ cây ngô mẫn cảm nhất với điều kiện hạn đó là thời kỳ
cây con và thời kỳ ra hoa. Do đó, chúng tôi đã đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu ở giai đoạn cây con trong điều kiện hạn nhân tạo (Bảng 3.1 và Hình 3.4).
Bảng 3.1. Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô nếp bị xử lý bởi hạn nhân tạo
TT Giống
Tỷ lệ thiệt hại (%)
Hạn 1 ngày Hạn 3 ngày Hạn 5 ngày Hạn 7 ngày Hạn 9 ngày Hạn 11 ngày 1 BN 0,00 13,89±0,57 27,78±0,58 33,33±0,58 57,33±0,57 85,42±0,10 2 BS1 0,00 11,11±0,64 30,56±0,59 44,44±0,57 68,06±0,58 95,65±0,10 3 DG2 0,00 11,11±0,63 27,78±0,57 33,33±0,59 46,67±0,57 86,67±0,57 4 ĐX2 0,00 5,56±0,10 28,89±0,53 44,44±0,59 60,54±0,60 90,80±0,58 5 KL 0,00 16,67±0,57 31,67±0,57 44,44±0,58 67,41±0,58 93,94±0,58 6 Mo 0,00 5,56±0,56 11,11±0,61 33,33±0,61 44,44±0,57 85,33±0,57 7 NH 0,00 11,11±0,56 16,67±0,57 33,33±0,59 43,45±0,60 85,19±0,57 8 PT 0,00 11,11±0,57 22,22±0,56 33,33±0,63 53,33±0,00 84,76±0,10 9 TB 0,00 11,11±0,58 19,44±0,10 33,33±0,67 51,52±0,57 83,33±0,10 10 VK2 0,00 16,67±0,57 27,78±0,10 33,33±0,75 66,67±0,57 89,33±0,01
(n= 30, thí nghiệm lặp lại 3 lần, mức độ tin cậy 95%)
Tỷ lệ thiệt hại (hay mức độ thiệt hại) của mỗi giống ngô đƣợc xác định trên cơ sở theo dõi số cây héo, cây chết sau 3, 5, 7, 9 và 11 ngày hạn. Khi bị hạn, sự thoát hơi nƣớc vƣợt quá sự hấp thu nƣớc làm lƣợng nƣớc trong tế bào giảm, lúc này sự mất sức trƣơng thƣờng gây nên sự đóng lỗ khí khổng và giảm hoạt động quang hợp, gây tổn thƣơng cho cây [60]. Các giống khác nhau sẽ có những đáp ứng khác nhau để làm giảm hoặc tránh bị tổn thƣơng. Bảng 3.1 cho thấy: sau 3, 5, 7, 9 và 11 ngày gây hạn, cả 10 giống nghiên cứu đều chịu ảnh hƣởng của hạn và tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra tăng theo thời gian gây hạn. Sau 3 ngày gây hạn, các giống ngô bắt đầu bị ảnh hƣởng, lá non quăn lại, thân và rễ không bị ảnh hƣởng. Sau 5 ngày hạn, mức độ ảnh hƣởng
tăng lên rõ rệt. Đặc biệt sau 9 ngày hạn, tất cả các giống ngô đều bị héo thân và lá, số lƣợng cây bị chết cũng tăng lên cao. Giống có tỷ lệ thiệt hại cao nhất là BS1 và KL (sau 3 ngày: 11,11% và 16,67%; sau 5 ngày: 30,56% và 31,67%; sau 7 ngày: 44,44% và 44,44%; sau 9 ngày: 68,06% và 67,41%; sau 11 ngày: 95,65% và 93,94%). Giống có tỷ lệ thiệt hại thấp nhất là Mo và NH, từ ngày hạn thứ 7 trở đi hai giống có tỷ lệ thiệt hại thấp hơn (sau 3 ngày: 5,56% và 11,11%; sau 5 ngày: 11,11% và 16,67%; sau 7 ngày: 33,33% và 33,33%; sau 9 ngày: 44,44% và 43,45%; sau 11 ngày: 85,33% và 85,19%).
Hình 3.4. Đồ thị mô tả tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô trong quá trình xử lý hạn Nghiên cứu về ảnh hƣởng của hạn đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây húng, Moeini Alishah và cộng sự (2006) nhận thấy: khi mức độ hạn tăng, chiều cao cây, đƣờng kính thân, số lá và diện tích lá giảm có ý nghĩa so với đối chứng [116]. Kết quả phân tích khả năng chịu hạn giai đoạn cây non 3 lá của cây ngô có sự tƣơng đồng với kết quả đánh giá khả năng chịu hạn trên
3.1.2.2. Chỉ số chịu hạn tương đối của 10 giống ngô trong điều kiện hạn nhân tạo
Tính chống chịu của cây trồng nói chung và khả năng chịu hạn của cây