6. Cấu trúc luận văn
2.3.2. Phương pháp hóa sinh
2.3.2.1. Nghiên cứu một số điều kiện sinh trưởng của các chủng nấm men
❖ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các
chủng nấm men
Để xác định nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của các chủng nấm men, chúng tôi tiến hành cấy nấm men sau khi đã được nhân giống trong ống thạch nghiêng vào các bình tam giác 250ml có chứa sẵn 200ml môi trường Hansen lỏng, đặt lên máy lắc ngang với tốc độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28 – 320C) và nuôi cấy trong 24 giờ để tạo dịch nấm men thuần chủng. Pha loãng
dịch nấm men thuần chủng ở các nồng độ thích hợp, tiến hành cấy vào các đĩa petri (lặp lại 3 lần cho mỗi nhiệt độ) và dùng que trang trang đều đĩa. Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm ở các nhiệt độ: 250C 300C, 350C, 400C, ủ trong 24 giờ. Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa ra, đưa lên máy đếm tự động để đếm số lượng khuẩn lạc (CFU – colony forming unit).
❖ Xác định hàm lượng glucose tối ưu cho sự sinh trưởng của các
chủng nấm men
Tiến hành cấy các chủng nấm men sau khi đã nhân giống trong ống thạch nghiêng vào môi trường Hansen lỏng với nồng độ glucose lần lượt là 10g/l, 15g/l, 20g/l, 25g/l, 30g/l, đặt lên máy lắc ngang với tốc độ 150 vòng/phút, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng (28 – 320C). Định kì sau cứ sau 24 giờ, xác định số lượng tế bào của các chủng nấm men bằng cách đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu và tính số lượng tế bào theo công thức ở mục 2.3.1.1.
❖ Xác định hàm lượng pepton tối ưu cho sự sinh trưởng của các chủng nấm men
Tiến hành cấy các chủng nấm men sau khi đã nhân giống trong ống thạch nghiêng vào môi trường Hansen lỏng với nồng độ pepton lần lượt là 5g/l, 10g/l, 15g/l, 20g/l, đặt lên máy lắc ngang với tốc độ 150 vòng/phút, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng (28 – 320C). Định kì sau cứ sau 24 giờ, xác định số lượng tế bào của các chủng nấm men bằng cách đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu và tính số lượng tế bào theo công thức ở mục 2.3.1.1.
2.3.2.2. Phương pháp xác định khả năng phân giải các nguồn Cacbon của các chủng nấm men
Tiến hành cấy điểm các chủng nấm men trên đĩa petri có chứa môi trường thạch Sabouraud nhưng lần lượt thay bởi các nguồn Cacbon khác nhau: saccharose, maltose, glucose và tinh bột tan. Định kì cứ sau 24 giờ:
- Xác định khả năng phân giải đường bằng cách đo trực tiếp đường kính vòng phân giải (D, mm).
- Xác định khả năng phân giải tinh bột bằng cách phủ lên mặt môi trường một lớp dung dịch lugol, để sau 15 phút và đo đường kính vòng phân giải (D, mm).
2.3.2.3. Khảo sát khả năng lên men rượu
Các chủng nấm men được thử khả năng lên men rượu trong dung dịch đường khử (200 Brix) được chuẩn bị từ cơm chín sau quá trình đường hóa bằng nấm mốc Mucor sp.
Chuẩn bị dịch đường khử: 100g gạo cùng với 120ml nước cất được nấu chín thành cơm, để nguội 35 – 400C, sau đó chủng mốc bằng cách lấy toàn bộ bào tử và khuẩn ty của mốc Mucor sp. đã ủ 4 ngày ở 300C trên 1 đĩa môi trường Czapeck – Doc và trộn thật đều. Cơm đã chủng mốc được ủ trong 3 ngày ở 300C và sau đó thu hoạch bằng cách ly tâm (7000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C) để lấy dịch đường khử (200 Brix).
Quy trình lên men trong dịch đường khử: 150ml dung dịch đường khử ở 200 Brix chứa trong bình tam giác 250ml, đậy bằng nút gòn. Khử trùng bằng autoclave ở 1150C trong 10 phút, để nguội đến khoảng 35 – 400C. Chủng 3ml dịch men giống đã được nuôi ủ sau 24 giờ và trộn đều. Thay nút gòn bằng cách đậy waterlock, ủ 5 ngày ở 30oC trong điều kiện kị khí. Thực hiện phân tích các chỉ tiêu đếm số lượng bọt khí được sinh ra trong waterlock ở mỗi ngày, xác định hàm lượng cồn và đo pH.