3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu
1.5.3. Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS)
Trong sắc ký lỏng ghép khối phổ, đầu dò khối phổ có các bộ phận chính sau đây: Bộ tạo ion, bộ phân tích khối và bộ dò ion. Xin trình bày sau đây hai bộ phận cơ bản nhất là bộ tạo ion và bộ phân tích khối phổ.
Bộ tạo ion
Sự tạo ion trong sắc ký lỏng ghép khối phổ được thực hiện ở áp suất thường. Có hai cách tạo ion chính: Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI, Atmospheric pressure chemical ionization) và ion hóa bằng cách phun điện tử ESI (Electrospray ionization). Hai kỹ thuật ion hóa này được xem là loại ion hóa “mềm” (soft ionization), ít phân mảnh hơn so với ion hóa điện tử (electron ionization) trong GC/MS.
a) Kiểu ion hóa APCI
Nguyên tắc hoạt động: Phân tử chất phân tích và dung môi đi qua bộ phận gia nhiệt khoảng 350oC sẽ bị hóa hơi và được khí nitơ đẩy vào vùng phóng điện. Ở đây, các phân tử khí bị ion hóa bởi kim phóng điện theo hai cơ chế tạo ion dương hoặc tạo ion âm.
• Tạo ion dương
N2 + e- → N2 +
H2O + e- → H2O+ + 2e- H2O + H2O.+ → H3O+ + .OH
M + H3O+ → MH+ + H2O [ phản ứng giữa ion và phân tử]
• Tạo ion âm
Với những phân tử có H linh động trong vùng phóng điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần còn lại là một anion
Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống ion hóa theo kỹ thuật APCI
Chú thích:
• Ống phun khí (1) : phun khí đẩy chất phân tích dưới dạng hơi vào vùng
phóng điện
• Kim phóng điện (2): được áp thế có thể đến 3-4kV, có chức năng ion hóa chất
phân tích.
•Hút khí (3): là đường dẫn mà ở đầu củađường dẫn này có đặt một bơm tạo
chân không, dùng để tạo chân không cho hệ thống MS, khi chân không đạt 10-7 torr máy MS mới hoạtđộng được.
• Skimmer (4): bộ phận gạn lọc nhằm loại bỏ một phần các chất gây nhiễu,
không cho vào bộ phận phân tích khối.
•Bộ phận gia nhiệt (5): bộ phận dùng để hóa hơi dung môi, bao bọc chất
phân tích.
b) Kiểu ion hóa ESI
Nguyên tắc hoạt động: Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại có điện thế từ 3- 5 kV, sau đó được phun sương bằng khí N2 tạo thành những hạt sương nhuyễn, có mang điện tích, thoát ra từ đầu ống mao quản. Các phân tử dung môi từ từ bốc hơi. Các hạt mang điện tích
có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ bể dần ra thành những hạt nhỏ mang điện tích và cuối cùng cho ra ion. Các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận phân tích ion qua một hệ thống dẫn ion. Dung môi và khí N2 bị bơm hút ra ngoài.
So với kỹ thuật APCI thì kỹ thuật ESI ít tạo ra sự phân mảnh hơn. ESI được sử dụng nhiều hơn cho phân tử phân cực và có phân tử khối lớn
Hình 1.4. Sơ đồ hệ thống ion hóa theo ESI
c) So sánh hai kỹ thuật APCI và ESI
Cả hai kỹ thuật đều thuộc loại ion hóa “mềm” nghĩa là ít tạo sự phân mảnh ion thành những ion nhỏ hơn và do đó, trong nhiều trường hợp, còn thấy được ion tạo thành từ phân tử ban đầu: Ion dương [M+H]+ hay ion âm [M-H]-. Hơn nữa, nếu có sự phân mảnh ion thì cách phân mảnh cũng có thể đơn giản hơn so với ion hóa “cứng” (hard ionization), giúp sự đoán nhận cấu trúc hóa học ban đầu dễ dàng hơn.
Cả hai kỹ thuật đều có thể tạo ion âm hay dương tùy cấu trúc hóa học, tuy nhiên APCI có thể tạo sự phân mảnh nhiều hơn.
Về nguyên tắc, APCI được sử dụng nhiều cho những phân tử phân cực vừa, có phân tử khối nhỏ, dưới 1000 amu. ESI được sử dụng cho phân tử phân cực nhiều hơn và có khối lượng phân tử lớn.
Với kỹ thuật ESI, có thể tạo ion đa điện tích trong trường hợp các phân tử có phân tử khối lớn và có thể nhận nhiều proton (ion dương) hay mất nhiều proton (ion âm). Ngược lại kỹ thuật APCI chỉ có thể cho hoặc nhận một proton H+.
Với ESI, tốc độ pha động 5µl-1ml/phút tùy kích cỡ cột sắc ký.
Với APCI, tốc độ pha động thường khoảng 0,1-2ml/phút tùy theo kích cỡ cột sắc ký.
Bộ phân tích khối
a) Bộ phân tích khối một tứ cực
Tứ cực gồm 4 thanh kim loại hình trụ hoặc hyperbol được đặt song song nhau (hãng Thermo Fisher hay Agilent), chịu tác dụng đồng thời của điện thế một chiều U và điện thế xoay chiều cao tần V, từng cặp đối diện được nối vào cùng một cực của điện thế.
Hình 1.5. Bộ phân tích khối một tứ cực
Tứ cực Hyperbol
Nguyên tắc vận hành: Về nguyên tắc, có hai chế độvận hành:
• SIM ( Selected ion monitoring)
Ứng với một ion được chọn có trị số m/z, thì U và V phải có trị số xác định
(được tính bởi phần mềm của máy) để cho phép ion đi xuyên qua được tứ cực và đến được bộ dò ghi nhận. Những ion có trị số m/z lớn hay nhỏ hơn không xuyên qua tứ cực được. Do đó, tứ cực còn được xem như có vai trò lọc khối (mass filter). Độ phân giải có thể được điều chỉnh bởi cặp U, V (về thực tế, điều nầy có thể do người thao tác cài đặt sai số ∆m trên phân tử khối m của ion, ∆m càng nhỏ thì độ phân giải càng cao), tuy nhiên khi tăng độ phân giải thì độ nhạy sẽ giảm.
• FULL SCAN
Để thu được các ion trong một khoảng khối lượng xác định đã được cài đặt, thì phải thay đổi U và V liên tục nhưng vẫn giữ tỉ lệ U/V không đổi. Độ phân giải phổ tùy thuộc tỉ lệ này.
Hình 1.7. Chế độ Full Scan
Lưu ý:
-Khi U = 0, chỉ còn điện thế xoay chiều cao tần V, tứ cực không còn đóng vai trò lọc khối nữa. Tất cả ion đều đi qua tứ cực được, lúc bấy giờ tứ cực chỉ đóng vai trò chuyển ion. Đặc tính này được áp dụng trong sự chuyển ion từ nguồn tạo ion đến bộ phân tích khối trong đầu dò khối phổ, tuy nhiên thay vì dùng tứ cực thì người ta dùng lục cực (hexapole) hay bát cực (octapole) có đặc tính chuyển ion tốt hơn.
-Khối phổ một tứ cực vận hành theo chế độ Full Scan có độ nhạy không cao, trái lại với chế độ SIM, độ nhạy đạt khá cao, cho nên trong phân tích vết, phải luôn luôn sử dụng SIM để định lượng. Ngoài ra, với đầu dò khối phổ một tứ cực, với những nền mẫu phức tạp, việc chuẩn bị mẫu phải được thực hiện rất kỹ lưỡng để giảm bớt nhiễu nền, dù vậy độ nhạy và độ chọn lọc cũng kém hơn so với đầu dò khối phổ ba tứ cực.
b) Bộ phân tích khối ba tứ cực
Với hệ khối phổ (MS) ba tứ cực Q1, Q2, Q3, vai trò của bộ tứ cực thứ nhất Q1 và thứ ba Q3 là tách và cô lập ion, còn Q2 có vai trò phân mảnh các ion chuyển từ Q1
sang. Các ion này còn gọi là tiền ion (precursor ion) được chọn thông qua Q1 và tiếp đó được cung cấp đủ năng lượng, gọi là năng lượng phân mảnh hay va chạm (collision energy) để khi va chạm với argon (hay N2) được cấp vào Q2, bị phân mảnh tạo ra các mảnh ion đặc trưng cho phân tử hóa chất. Xu thế hiện nay là chọn một lục cực dùng làm Q2 để tăng tốc độ chuyển ion vào Q3, tránh hiện tượng nhiễm ion chéo (cross-talk) ảnh hưởng đến việc định lượng.
Hình 1.8. Sơ đồ bộ phân tích khối ba tứ cực
c)Ưu thế của đầu đò khối phổ ba tứ cực
-Thông qua hai lần phân mảnh ion, việc nhận danh chất phân tích trở nên đúng hơn.
-Sự khử nhiễu nền đạt cao hơn, khiến độ nhạy được tăng lên. Trong phân tích dư lượng, áp dụng chế độ MS/MS-SRM cho kết quả định lượng tốt hơn.
-Ngoài ra với độ nhạy khá cao của thiết bị LC-MS/MS hiện nay, có thể sử dụng ít mẫu trong chuẩn bị mẫu, vừa tốn ít hóa chất, vừa làm giảm đáng kể hiệu ứng nền trong tách chiết cũng như trong hiệu suất tạo ion tại bộ phận thu nhận tín hiệu khối phổ.
Hình 1.9 Chế độ vận hành khối phổ ba tứ cực
Chú thích: Với đầu dò khối phổvận hành theo chế độMS/MS
• Q1: hệ thống tứ cực thứ nhất có nhiệm vụ tiếp nhận tiền ion
• Q2: hệ thống tứ cực thứ hai, nơi xảy ra sự phân mảnh tiền ion
• Q3: hệ thống tứ cực thứ ba có nhiệm vụ nhận tất cả ion con sinh ra ở Q2 (Full MS/MS hay Product Ion) hay chỉ một số ion nhỏ nhất định (SRM).