3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu
2.3.2. Tối ưu các thông số kĩ thuật điều kiện chạy của máy khối phổ MS/MS
Để đảm bảo độ phân giải và độ nhạy của thiết bị LC-MS/MS trong phân tích vết OTA, cần phải tối ưu hóa các thông số vận hành của máy.
2.3.2.1. Khảo sát quá trình quét phổ các ion chất chuẩn (Sử dụng chế độ Full scan)
Để khảo sát các thông số của hệ thống máy LC-MS/MS, trước hết cần phải quét phổ toàn phần (chế độ full scan) để xác định ion cần phân mảnh (tiền ion). Từ tiền ion, xác định các điều kiện phân mảnh, đặc biệt là năng lượng phân mảnh (Collision Energy), điện thế hệ thống dẫn (tube lens) để có được cường độ tiền ion đạt khoảng 10% cường độ mảnh ion lớn nhất dùng để định lượng. Ion con có cường độ cao nhất được sử dụng làm ion định lượng. Quá trình khảo sát gồm các bước sau:
-Chuẩn bị dung dịch chuẩn OTA.
- Điều chỉnh khoảng khối lượng nguyên tử cần quét để thu được đủ số ion cần thiết từ 50 đến 400 Da.
-Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn vừa chuẩn bị vào đầu dò khối phổ 3 tứ cực theo chế độ Full scan MS. Từ sắc đồ toàn phần (Full scan), có được khối phổ của OTA, trên đó xác định chính xác tỉ số m/z của tiền ion và một số ion con. Từ các tiền ion, dùng phần mềm máy tính xác định sơ bộ các điều kiện phân mảnh để có được các ion con.
2.3.2.2. Khảo sát năng lượng phân mảnh của các tiền ion (chọn chế độ SRM: Selected Reaction Monitoring)
Về nguyên tắc, trong máy khối phổ, ion phân tử có năng lượng cao có khả năng bị phân mảnh dưới tác dụng va đập của các nguyên tử khí trơ (argon). Tùy thuộc vào giá trị năng lượng phân mảnh (collision energy), các ion con sinh ra có độ nhạy khác nhau. Vì vậy, muốn thu được ion định lượng và ion xác nhận có độ nhạy cao nhất thì cần phải xác định được năng lượng phân mảnh tối ưu này. Các bước khảo sát được tiến hành như sau:
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn.
- Chọn m/z của tiền ion, dùng phần mềm để bước đầu xác định năng lượng phân mảnh và điện thế bộ chuyển ion (tube lens) để có các mảnh ion con có độ nhạy cao (coarse tuning).
Điều chỉnh năng lượng phân mảnh tiền ion, mỗi lần tăng lên hoặc giảm xuống một hoặc hai đơn vị cho đến khi nào độ nhạy tức cường độ mũi sắc ký không tăng nữa thì dừng lại (fine tuning).
2.3.2.3. Khảo sát thành phần pha động
Pha động trong sắc ký lỏng vừa đóng vai trò đưa chất phân tích vào cột vừa là dung môi rửa giải. Sau khi được giữ lại trên pha tĩnh, các chất sẽ được rửa giải ra khỏi cột ở các thời điểm khác nhau tùy theo khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh, tùy thuộc vào khả năng rửa giải và tốc độ dòng của pha động.
Pha động không chỉ ảnh hưởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như acid acetic, acid formic, amoni acetate... Trong phương pháp nghiên cứu, pha tĩnh sử dụng là cột C18, ít phân cực nên pha động phải là hệ dung môi phân cực. Chất tan ít phân cực sẽ bị lưu giữ trong cột lâu hơn chất tan phân cực. Do tính chất phân cực trung bình của Ochratoxin A nên Tôi chọn pha động để khảo sát như sau:
+ Methanol, CH3COONH4 10 mM (80:20) [3] + Acetonitrile: nước: acetic acid (80:20:1) [46] + Acetonitrile: nước:Acid Formic(80:20:1) [44]
- Chuẩn bị chuẩn nồng độ khoảng 2,5 ppb được pha trong Acetonitrile.
-Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn vừa chuẩn bị với các thông số đã tối ưu hóa, dùng cột sắc ký C18 và pha động chạy phân tích HPLC với tốc độ dòng 0,1ml/phút.
-Thực nghiệm cho kết quả thống kê.
2.3.2.4. Khảo sát tốc độ pha động
Với đầu dò MS, đối với chế độ vận hành ESI, tốc độ dòng không được quá lớn vì sẽ gây trở ngại cho tiến trình desolvat ion do dung môi không kịp bốc hơi. Sự tạo ion riêng rẻ sẽ bị chậm lại, độ nhạy sẽ giảm. Thông thường, tốc độ dòng được khuyến cáo không quá 1 mL/phút cho ESI với thiết bị LC-MS/MS thông thường (áp suất ≤ 400 bar). Trong trường hợp phân tích OTA với thiết bị Agilent 6410 Triple quad LC/MS/MS, sử dụng cột Cột XDB-C18(2.1mm × 100 mm × 1.8 μm) tốc độ dòng được chọn là 0,1-0,2 mL/phút để thực hiện các phép tối ưu hóa thiết bị.
Tốc độ pha động ảnh hưởng đến thời gian rửa giải và lượng dung môi tiêu tốn. Vì pha tĩnh là cột ngắn nên chọn tốc độ pha động khảo sát lần lượt là: 0,1 ml/phút; 0,2 ml/phút.
- Chuẩn bị chuẩn được pha trong Acetonitrile. Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn vừa chuẩn bị với pha động đã tối ưu hóa, dùng cột sắc ký C18 và pha động chạy phân tích HPLC với tốc độ dòng lần lượt là: 0,1 ml/phút; 0,2 ml/phút.
- Đánh giá: thực nghiệm cho kết quả thống kê thời gian lưu của chất chuẩn và diện tích chất chuẩn.
2.3.2.5. Phương pháp tách chiết mẫu
Chọn dung môi dễ hoà tan chất phân tích để chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu. Dung môi đó có thể là: chloroform, methanol, dung dịch cacbonate loãng,…Vì loại dung môi này thường kéo theo rất nhiều chất tạp khác có tính chất tương tự chất phân tích bị chiết vào nên rất cần loại bớt các chất tạp này. Chiết pha rắn là một phương pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm sạch mẫu phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha rắn. Sau đó chất phân tích được rửa giải bằng một lượng nhỏ dung môi thích hợp.
Chọn quy trình xử lý mẫu: Khảo sát sơ bộ trên 3 quy trình xử lý mẫu (mỗi
- Quy trình 1 [27]
Cân 10 g mẫu cà phê bột đã đồng nhất vào bình tam giác 250 ml. Thêm 100 µl chuẩn 100 ng/ml, thêm 200 ml NaHCO3 1%, lắc 30 phút. Lọc lấy 10 ml dịch chiết, thêm 10 ml đệm phosphat saline (PBS) pH=7-8. Hỗn hợp dịch chiết được qua cột chiết pha rắn Ochra Test WB. Sau đó, cột chiết được rửa tạp bằng 10 ml nước cất. Chất phân tích được rửa giải bằng 3 ml MeOH. Dịch rửa giải được đem thổi khô rồi hòa cặn lại bằng 1 ml MeOH, đem đi đo máy.
- Quy trình 2 [45]
Cân 25g mẫu cà phê bột đã đồng nhất vào bình tam giác 250 ml. Thêm 100 µl chuẩn 100 ng/ml, thêm 100 ml AcN:H2O (84:16), lắc 30 phút. Lọc lấy 8 ml dịch chiết. Hỗn hợp dịch chiết được qua cột chiết pha rắn Ochra Test WB. Sau đó, cột chiết được rửa tạp bằng 10 ml nước cất. Chất phân tích được rửa giải bằng 3 ml MeOH. Dịch rửa giải được đem thổi khô rồi hòa cặn lại bằng 1 ml MeOH, đem đi đo máy.
- Quy trình 3 [9], [46]
Cân 12,5 g mẫu cà phê bột đã đồng nhất vào bình tam giác 250 ml. Thêm 100 µl chuẩn 100 ng/ml, thêm 100 ml methanol: NaHCO3 3% (50:50), lắc 30 phút. Lọc lấy 4 ml dịch chiết, thêm 96 ml đệm phosphat saline (PBS) pH=7. Hỗn hợp dịch chiết được qua cột chiết pha rắn Ochra Test WB. Sau đó, cột chiết được rửa tạp bằng 10 ml nước cất. Chất phân tích được rửa giải bằng 3 ml MeOH. Dịch rửa giải được đem thổi khô rồi hòa cặn lại bằng 1 ml MeOH, đem đi đo máy.
Đánh giá hiệu suất thu hồi và chọn được quy trình xử lý mẫu tối ưu.
2.3.2.6. Chọn cột chiết pha rắn
Để loại bỏ nhiễu nền khỏi mẫu phân tích và làm tăng nồng độ chất phân tích trong mẫu phân tích bằng thiết bị đo.
Chiết pha rắn là kỹ thuật rất tiện lợi dùng chuẩn bị mẫu trong sắc ký, kỹ thuật chiết pha rắn có thể loại bỏ các cấu tử gây nhiễu, cô lập có chọn lọc chất phân tích trong phân tích vết để đạt hiệu quả cao nhất. Sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn mang đến nhiều thuận lợi như tiêu tốn ít lượng dung môi, tiết kiệm được thời gian phân tích và thiết bị thường dễ sử dụng.
Có nhiều loại cột SPE dùng để chiết và làm sạch chất phân tích. Cột SPE là những cột nhỏ bằng nhựa bền, có dung tích tùy thuộc vào khối lượng chất hấp phụ được nhồi vào cột và tùy thuộc vào thể tích dung dịch chứa chất phân tích đi qua cột.
Vì Ochratoxin A có tính axit yếu và nền mẫu cà phê rất phức tạp do ảnh hưởng bởi màu nên chúng tôi chọn 3 loại cột để khảo sát là cột C18, cột Ochra Test WB và cột Mycosep 228 Romer.
-Cột C18 [3]
-Cột Ochra Test WB: Cột miễn nhiễm chứa các kháng thể Ochratoxin A -Cột Mycosep 228 Romer: Cột ái lực miễn dịch
Nguyên tắc hoạt động của cột chiết pha rắn gồm các bước sau:
Hoạt hóa cột
Đây là công việc cần thiết đảm bảo cho cột được cân bằng và tương tác tốt của chất hấp phụ với chất phân tích. Mục đích là để loại trừ các chất bẩn có thể có trong cột trước khi sử dụng, đồng thời chuẩn bị cột đạt được điều kiện tương hợp với dung dịch sắp đưa vào để tách chiết chất cần phân tích từ hỗn hợp.
- Cột C18: Hoạt hóa bằng 5ml MeOH, 5mlH2O. - Cột Ochra Test WB: Đã chứa sẵn dung dịch hoạt hóa.
- Cột Mycosep 228 Romer: Theo hướng dẫn sản xuất cột, không hoạt hóa.
Nạp mẫu vào cột
Cho mẫu từ từ qua cột, đảm bảo vận tốc khoảng 3ml/phút.
Rửa cột
Rửa cột với dung môi thích hợp, mục đích rửa để loại ra khỏi cột các tạp chất tương tác yếu với cột SPE, nhưng phải bảo đảm chất phân tích còn giữ lại trên cột.
Hình 2.2. Nguyên tắc hoạt động của cột SPE (SCX)
Rửa giải
Thường dùng dung dịch MeOH để rửa giải (tốc độ chậm khoảng 1 ml/phút). Chất phân tích được giải phóng và được dung môi tách ra khỏi cột. Rửa với tốc độ chậm (1ml/phút).
Làm giàu chất phân tích
Dung dịch mẫu sau khi làm sạch bằng cột SPE thường được thổi khô bằng khí N2 hoặc dòng không khí, hoặc dùng máy cô quay chân không, để đuổi sạch dung môi. Cặn còn lại được hòa tan chính xác bằng một lượng nhỏ dung môi thích hợp trước khi đưa vào máy phân tích.
Đánh giá qua hiệu suất thu hồi và chọn được loại cột chiết pha rắn tối ưu.