3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu
3.5. Chọn cột chiết pha rắn
Để loại bỏ nhiễu nền khỏi mẫu phân tích và làm tăng nồng độ chất phân tích trong mẫu phân tích bằng thiết bị đo.
Vì Ochratoxin A có tính axit yếu và nền mẫu cà phê rất phức tạp do ảnh hưởng bởi màu nên chúng tôi chọn 3 loại cột để khảo sát là cột C18, cột Ochra Test WB và cột Mycosep 228 Romer.
12,5g mẫu/bình tam giác 250ml
Lắc, siêu âm
+50 ml MeOH
+50ml NaHCO3 3%
Lọc lấy 4ml dịch chiết +96ml PBS
Cột chiết pha rắn Ocha Test WB
Rửa tạp, 10ml nước cất
Rửa giải 4ml MeOH
Thổi khô, hòa cặn 0,5 ml MeOH
Vial
Sử dụng nền mẫu cà phê không phát hiện Ochratoxin A. Quá trình chiết mẫu được thực hiện theo quy trình 3. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.6. Kết quả quá trình chiết mẫu
Cột chiết C thêm chuẩn,
ng/ml Kết quả Ochratoxin A C18 10 C (ng/ml) Không đọc được H (%) - Ochra Test WB 10 C (ng/ml) 8,45 H (%) 84,5 Mycosep 228 Romer 10 C (ng/ml) Không đọc được H (%) -
Nhận xét: Từ kết quả thu được ta nhận thấy để chiết OTA, việc sử dụng cột chiết pha rắn Ochra Test WB tốt hơn so với 2 cột C18 và Mycosep 228 Romer. Do đó, Tôi chọn cột chiết Ochra Test WB để làm sạch dịch chiết.
Hình 3.8. Sắc kí đồ cột chiết C18
Hình 3.9. Sắc kí đồ cột chiết Ochra Test
3.6. Thẩm định phương pháp phân tích 3.6.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc 3.6.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc
- Đối với kỹ thuật MS cần đáp ứng được yêu cầu về điểm IP (điểm nhận dạng- identification point). Hội đồng Châu Âu quy định cách tính điểm IP đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-MS/MS) là 4, tức là cần 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con (theo EC657/2002).
Bảng 3.7. Bảng kết quả khảo sát ion mẹ và 2 ion con của Ochratoxin A
Chuẩn Ion mẹ Ion con Số điểm IP
Ochratoxin A 404
358
4 239
Để xác định chắc chắn phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu / chọn lọc cao, tiến hành phân tích các mẫu trắng. Yêu cầu kết quả mẫu trắng không cho tín hiệu phân tích. Mẫu trắng thêm chuẩn cho tín hiệu phân tích.
Bảng 3.8. Kết quả phân tích chất chuẩn, mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn
1 Lần Thời gian (phút) Diện tích peak
chất chuẩn 2,5ppb 1 3,130 4731 2 3,137 4524 3 3,123 4669 4 3,109 4940 5 3,130 4432 Mẫu trắng 1 - 0 2 - 0 3 - 0 4 - 0 5 - 0 6 - 0 Mẫu trắng thêm chuẩn 2,5ppb 1 3,204 4350 2 3,204 4325 3 3,171 4474 4 3,225 4902 5 3,259 4694 6 3,245 4349
Nhận xét: Phân tích các mẫu trắng lặp lại 6 lần, kết quả là mẫu trắng không có tín hiệu của OTA. Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn ở hàm lượng 2,5 ppb, lặp lại 6 lần. So sánh kết quả mẫu trắng thêm chuẩn với mẫu trắng, sắc đồ của hai nhóm mẫu thấy mẫu thêm chuẩn cho sắc đồ khối phổ đạt số điểm IP = 4. Như vậy phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu đáp ứng được yêu cầu. Thời gian lưu của mẫu trắng thêm chuẩn gần với thời gian lưu của chất chuẩn.
Hình 3.10. Sắc kí đồ chất chuẩn OTA 2,5ppb
Hình 3.12. Sắc kí đồ mẫu trắng thêm chuẩn 2,5 ppb
3.6.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Sau khi thực hiện khảo sát, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.9. Sự phụ thuộc của diện tích vào nồng độ
Nồng độ
(ng/ml) 1 5 10 50 100 200 300 500 1000
Diện tích
Peak 1652 8475 18787 83384 167875 335118 503527 827970 1007538
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích Peak vào nồngđộ OTA
0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 0 200 400 600 800 1000 1200 Series1
Nhận xét: Từ đồ thị ta thấy giới hạn tuyến tính (LOL) của OTA là 500 ng/ml. Như vậy từ kết quả ở trên có thể chỉ ra khoảng tuyến tính của OTA là 1 ng/ml-500 ng/ml.
-Xây dựng đường chuẩn: Trong quá trình thử nghiệm tùy theo hàm lượng chất phân tích có thể xây dựng đường chuẩn từ 3-6 điểm trong khoảng tuyến tính sao cho thích hợp.
Phân tích dãy chuẩn với nồng độ khác nhau ở các nồng độ: 1 ng/ml; 2,5 ng/ml; 5 ng/ml; 10 ng/ml; 20 ng/ml; 50 ng/ml. Mỗi nồng độ làm 3 lần.
Bảng 3.10. Kết quả đường chuẩn
Lần phân tích Nồng độ chuẩn OTA, ng/ml 1 2,5 5 10 20 50 1 1652 4575 8475 18787 32894 83384 2 1669 4604 8404 18601 32982 85310 3 1699 4668 8468 18228 32751 87567
Hình 3.14. Đường chuẩn của OTA
Nhận xét: Nhận thấy hệ số hồi quy tuyến tính R của đường chuẩn trên nằm trong khoảng: 0,995 ≤ R ≤1. Do vậy đường chuẩn dựng ở trên chấp nhận được.
y = 1703;1x + 51;429 R² = 0;9986 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 0 10 20 30 40 50 60
Hình 3.15. Sắc kí đồ chuẩn OTA 1 ng/ml
Hình 3.16. Sắc kí đồ chuẩn OTA 10 ng/ml
Hình 3.18. Sắc kí đồ chuẩn OTA 100 ng/ml
Hình 3.19. Sắc kí đồ chuẩn OTA 200 ng/ml
Hình 3.21. Sắc kí đồ chuẩn OTA 500 ng/ml
Hình 3.22. Sắc kí đồ chuẩn OTA 1000 ng/ml
3.6.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Để xác định giới hạn phát hiện dựa trên độ lệch chuẩn, tiến hành làm trên nền mẫu thử. Làm 10 lần song song, thêm chuẩn ở nồng độ 5 ng/ml (gấp 5 lần LOD ước lượng, LOD ước lượng của máy là: 1 ng/ml). Thực hiện tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã tối ưu hóa ở trên. Phân tích mẫu 10 lần lặp lại, tính giá trị trung bình Xtb và độ lệch chuẩn SD.
Bảng 3.11. Kết quả xác định LOD, LOQ của OTA
Kết quả Lần phân tích Hàm lượng OTA
(ng/ml) Xi (ng/ml) 1 4,17 2 4,29 3 4,37 4 4,00 5 4,72 6 4,39 7 4,17 8 4,30 9 4,37 10 4,00 Trung bình (Xtb) (ng/ml) 4,28 Độ lệch chuẩn (SD) 0,21 LOD (ng/ml) 0,63 LOQ (ng/ml) 2,11 F 6,65
Nhận xét: Từ bảng kết quả thu được nhận thấy giá trị F (4≤F≤10) thỏa mãn yêu cầu. Vì vậy nồng độ dung dịch thử là phù hợp và các giá trị LOD, LOQ thu được ở bảng trên là đáng tin cậy.
Hình 3.23. Sắc kí đồ mẫu thêm chuẩn OTA 5 ng/ml
3.6.4. Độ chính xác (độ chụm và độ đúng)
Thêm chuẩn ở ba mức nồng độ là mức thấp, trung bình và cao trong khoảng nồng độ làm việc. Theo quy định của Hội đồng Châu Âu đối với các chỉ tiêu an toàn (các chỉ tiêu thuộc nhóm độc, có quy định giới hạn cho phép) thêm chuẩn vào mẫu trắng ở ba mức nồng độ tại 0,5 lần, 1 lần và 2 lần giới hạn cho phép (MRL). Thêm chuẩn ở ba mức nồng độ là 2,5 ng/ml; 5 ng/ml; 10 ng/ml. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.12. Kết quả xác định RSD, H của OTA
Lần phân tích Nồng độ thêm chuẩn, ng/ml
2,5 5 10 1 2,23 4,17 8,35 2 2,48 4,30 8,74 3 2,43 4,37 8,33 4 2,31 4,00 8,98 5 2,23 4,73 8,40 6 2,48 4,39 8,11 X Trung bình 2,36 4,33 8,49 SD 0,12 0,24 0,31 RSD (%) 5,03 5,64 3,70 H(%) 94,54 86,57 84,86
Bảng 3.13. Qui định độ đúng và độ chụm của phương pháp phân tích định lượng phụ
thuộc nồng độ chất theo 2002/657/EC
Nhận xét: Theo 2 bảng trên, tại mức từ 10 – 100 µg/kg, hệ số biến thiên RSD ≤ 20%; hiệu suất thu hồi tại mức từ 1 – 10 µg/kg phải nằm trong khoảng 70 – 110%. Như vậy, phương pháp có độ đúng và độ chụm đạt yêu cầu.
3.6.5. Giới hạn lặp lại (r), giới hạn tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm (R)
Bố trí thí nghiệm với 3 mức thí nghiệm, mỗi mức được thực hiện bởi ba thử nghiệm viên thực hiện lặp lại sáu lần trong ba ngày khác nhau. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.14. Kết quả đánh giá độ tái lặp của Phòng thí nghiệm Lần phân tích Nồng độ 2,5 ng/ml Nồng độ 5 ng/ml Nồng độ 10 ng/ml TNV 1 TNV 2 TNV3 TNV 1 TNV 2 TNV3 TNV 1 TNV 2 TNV3 1 2,27 2,34 2,49 4,23 4,34 4,05 8,04 8,35 8,53 2 2,46 2,24 2,38 4,30 4,48 4,16 8,46 8,73 8,97 3 2,39 2,22 2,30 4,37 4,48 4,25 8,13 8,30 8,52 4 2,29 2,17 2,56 4,10 4,17 3,93 8,69 8,97 9,21 6 2,28 2,15 2,51 4,58 4,72 4,47 8,13 8,39 8,68 TB (ng/ml) 2,37 2,25 2,44 4,33 4,43 4,19 8,21 8,48 8,73 H (%) 94,63 90,03 97,68 86,56 88,61 83,78 82,10 84,76 87,28 Độ lệch chuẩn lặp lại SDr 0,094 0,096 0,097 0,16 0,18 0,19 0,32 0,31 0,30 RSDr 3,99 4,29 3,97 3,70 4,12 4,43 3,88 3,71 3,46 SDR 0,09 0,12 0,26 RSDR 4,09 2,81 3,06
Nhận xét: Theo AOAC appendix F, tại hàm lượng 10 ppb, RSD cho phép tối đa là 21%, cả 3 giá trị RSD thu được đều thỏa mãn yêu cầu.
3.7. Kết quả khảo sát mức độ tồn lưu dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột và đề xuất giải pháp đảm bảo chất lượng cà phê bột tại địa bàn Buôn Ma Thuột xuất giải pháp đảm bảo chất lượng cà phê bột tại địa bàn Buôn Ma Thuột
3.7.1. Kết quả khảo sát mức độ tồn lưu dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột tại địa bàn Buôn Ma Thuột địa bàn Buôn Ma Thuột
Từ phương pháp xây dựng được chúng tôi đã tiến hành đánh giá thực trạng nhiễm dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột trên địa bàn Buôn Ma Thuột với tổng số mẫu là 55 mẫu, mẫu được lấy ngẫu nhiên từ các cơ sở chế biến sản xuất cà phê và
từ chợ. Các mẫu được đồng nhất, sau đó được đem cân và tiến hành phân tích như qui trình đã tối ưu hóa ở trên. Mỗi mẫu tiến hành làm lặp lại 2lần, lấy kết quả trung bình và tính độ lệch chuẩn.
Kết quả phát hiện một số mẫu có chứa Ochratoxin A, tuy nhiên đều ở dưới ngưỡng cho phép. Hiệu suất thu hồi các mẫu thêm chuẩn đều nằm trong khoảng 70-110%.
Kết quả thu được khẳng định về chất lượng dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột trong giới hạn an toàn theo quy định, đảm bảo cho người tiêu dùng về chỉ tiêu này.
Bảng 3.15. Kết quả phân tích mẫu thực tế.
STT Tên mẫu Diện tích OTA m (g) C mẫu (ng/g)
1 Chợ-01 3478 12,5967 2,24
2 Chợ-02 Không phát hiện 12,5382 Không phát hiện
3 Chợ-03 815 12,5535 0,92
4 Chợ-04 Không phát hiện 12,5223 Không phát hiện 5 Chợ-05 Không phát hiện 12,5655 Không phát hiện
6 Chợ-06 738 12,5065 0,88
7 Chợ-07 Không phát hiện 12,59 Không phát hiện 8 Chợ-08 Không phát hiện 12,53 Không phát hiện
9 Chợ-09 3875 12,5934 2,45
10 Chợ-10 1472 12,5006 1,26
11 Chợ-11 Không phát hiện 12,6428 Không phát hiện 12 Chợ-12 Không phát hiện 12,5347 Không phát hiện
13 Chợ-13 574 12,5907 0,80
14 Chợ-14 Không phát hiện 12,57 Không phát hiện 15 Chợ-15 Không phát hiện 12,5442 Không phát hiện 16 Chợ-16 Không phát hiện 12,551 Không phát hiện
STT Tên mẫu Diện tích OTA m (g) C mẫu (ng/g)
17 Chợ-17 Không phát hiện 12,5161 Không phát hiện 18 Chợ-18 Không phát hiện 12,5511 Không phát hiện
19 Chợ-19 433 12,5042 0,74
20 Chợ-20 413 12,5135 0,72
21 Chợ-21 Không phát hiện 12,5066 Không phát hiện 22 Chợ-22 Không phát hiện 12,4998 Không phát hiện 23 Chợ-23 Không phát hiện 12,5034 Không phát hiện 24 Chợ-24 Không phát hiện 12,535 Không phát hiện 25 Chợ-25 Không phát hiện 12,5145 Không phát hiện 26 Chợ-26 Không phát hiện 12,5218 Không phát hiện 27 Chợ-27 Không phát hiện 12,5207 Không phát hiện 28 Chợ-28 Không phát hiện 12,5334 Không phát hiện 29 Chợ-29 Không phát hiện 12,5097 Không phát hiện 30 Chợ-30 Không phát hiện 12,5695 Không phát hiện 31 Chợ-31 Không phát hiện 12,5049 Không phát hiện 32 Chợ-32 Không phát hiện 12,5163 Không phát hiện 33 Chợ-33 Không phát hiện 12,5845 Không phát hiện 34 CS-01 Không phát hiện 12,5238 Không phát hiện 35 CS-02 Không phát hiện 12,5223 Không phát hiện 36 Cs-03 Không phát hiện 12,535 Không phát hiện
STT Tên mẫu Diện tích OTA m (g) C mẫu (ng/g)
38 CS-05 Không phát hiện 12,627 Không phát hiện 39 CS-06 Không phát hiện 12,6849 Không phát hiện 40 CS-07 Không phát hiện 12,5416 Không phát hiện 41 CS-08 Không phát hiện 12,5625 Không phát hiện 42 CS-09 Không phát hiện 12,5527 Không phát hiện 43 CS-10 Không phát hiện 12,6408 Không phát hiện 44 CS-11 Không phát hiện 12,6519 Không phát hiện 45 CS-12 Không phát hiện 12,62 Không phát hiện 46 CS-13 Không phát hiện 12,5128 Không phát hiện 47 CS-14 Không phát hiện 12,6548 Không phát hiện 48 CS-15 Không phát hiện 12,5424 Không phát hiện 49 CS-16 Không phát hiện 12,6117 Không phát hiện 50 CS-17 Không phát hiện 12,5418 Không phát hiện 51 CS-18 Không phát hiện 12,5065 Không phát hiện 52 CS-19 Không phát hiện 12,5005 Không phát hiện 53 CS-20 Không phát hiện 12,597 Không phát hiện 54 CS-21 Không phát hiện 12,5389 Không phát hiện 55 CS-22 Không phát hiện 12,535 Không phát hiện
Nhận xét: Thực trạng nhiễm Ochratoxin A vẫn còn hiện hữu mặc dù đã có những cảnh báo về khả năng nhiễm độc và độc tính cao của loại độc tố này. Kết quả phân tích cho thấy có 9 mẫu nhiễm Ochratoxin A trong tổng số 55 mẫu (chiếm 16,36%). Các mẫu nhiễm Ochratoxin A đều nằm trong giới hạn cho phép của Bộ Y tế. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Z.Ilic và cộng sự, khi khảo sát mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu cà phê Việt Nam, cuộc khảo sát thực địa đã được tiến hành tháng 3 năm 2000. Mẫu được thu thập từ khu vực Tây Nguyên Việt Nam, với phần lớn có nguồn gốc từ Đắk Lắk, Gia Lai và các khu vực xung quanh. Kết quả phân tích HPLC cho thấy trong đó có tới 8,7% là các chủng A. niger sinh độc tố Ochratoxin A [40]. Nghiên cứu của S.L.Leong và cộng sự về cà phê Việt Nam cũng cho thấy hầu hết các mẫu kiểm tra đều nhiễm nấm mốc trong đó chủ yếu là nhiễm A.niger [34].
Kết quả cũng phù hợp với báo cáo của Nguyễn Văn Thường và cộng sự tại dự án đặc biệt của FAO về cà phê trang trại tại 6 huyện tỉnh Đắk Lắk - Việt Nam niên vụ 2003-2004, kết quả cho thấy hầu hết các mẫu cà phê đều nhiễm nấm mốc và chủ yếu là chủng Aspergillus niger. Nhiều mẫu kiểm tra phát hiện Ochratoxin A ở mức 3-6ppb [12]. Theo nghiên cứu, khảo sát Nguyễn Thùy Châu và cộng sự, hầu hết các mẫu cà phê tại khu vực Tây Nguyên kiểm tra sau 1 tháng bảo quản đều nhiễm nấm mốc và hầu hết các mẫu hạt kiểm tra nhanh bằng phương pháp UV đều chứa chủng A. niger
sinh Ochratoxin A. 20% các mẫu khi phân tích chứa Ochratoxin A với hàm lượng từ 1-10ppb [2].
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu Mariana Tozlovanu khảo sát hàm lượng OTA của 30 loại cà phê rang mua trong các siêu thị của Pháp. Tất cả các mẫu có chứa OTA nằm trong khoảng từ dấu vết (<LOQ) đến 11,9 µg/kg [26]. Theo nghiên cứu của Martins ML 2003, 20 của 60 mẫu hạt cà phê xanh từ Brazil có mức thấp của Ochratoxin A. Hai mươi mẫu (33,3%) trong số 60 đã bị nhiễm độc tố ở mức từ 0,2 đến 7,3 µg/kg. Nồng độ trung bình là 2,38 µg/kg. Tất cả các mẫu dương tính cho thấy mức OTA dưới giới hạn được đề xuất bởi Liên minh châu Âu 8 µg/kg. Jorgensen đã xem xét mức độ nhiễm Ochratoxin A ở các mẫu cà phê rang ở các cửa hàng bán lẻ tại đức và đã tìm thấy ở tất cả các mẫu đều bị nhiễm ở mức độ thấp [24]. Năm 2002 Fazekas và cộng sự đã khảo sát mức độ nhiễm Ochratoxin A của cà phê Hungari. Nồng độ trung bình của Ochratoxin A trong 50 mẫu cà phê là: cà phê rang 0,5µg/kg, cà phê pha 0,72 µg/kg và tất cả các mẫu hỗn hợp 0,57 µg/kg. Các mức độ nhiễm Ochratoxin A này thấp hơn nhiều so với mức độ cho phép tối đa là 10 µg/kg trong cà phê rang ở Hungary [19]. Theo Taniwaki và cộng sự năm 2003 đã báo cáo mức độ nhiễm