3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích
2.3.3.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc
- Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện các chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự,... Trong phép phân tích định tính đó phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả là phải âm tính khi có mặt các chất có cấu trúc gần giống với chất phân tích. Trong phép phân tích định lượng, là khả năng phát hiện chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố, nhằm hướng đến kết quả chính xác.
- Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất trong một quy trình. Nếu chất cần phân tích phân biệt rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc.
-Để xác định tính đặc hiệu/ chọn lọc đối với sắc ký lỏng khối phổ chúng tôi sử dụng các phương pháp xác nhận (confirmation method). Đối với kỹ thuật MS cần đáp ứng được yêu cầu về điểm IP (điểm nhận dạng - identification point). Hội đồng Châu Âu quy định cách tính điểm IP đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC- MS/MS) là 4, tức là cần 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con (theo EC 657/2002).
-Tiến hành phân tích các mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn và chất chuẩn cùng nồng độ.
+ Mẫu trắng không được cho tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích.
+ Mẫu thêm chuẩn phải cho tín hiệu tại thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất chuẩn. Chênh lệch này không được quá 5% (Theo FDA)
2.3.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.
Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm cả các giới hạn này), tại đó
chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính.
- Khoảng tuyến tính: Để xác định khoảng tuyến tính thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi từ 1 ng/ml đến 1000 ng/ml và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích peak thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính. Yêu cầu tính tuyến tính R2> 0,99.
-Xây dựng đường chuẩn: Trong quá trình thử nghiệm tùy theo hàm lượng chất phân tích có thể xây dựng đường chuẩn 3-6 điểm trong khoảng tuyến tính sao cho thích hợp.
-Phân tích đường chuẩn với chuẩn tinh khiết. Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (6 nồng độ). Xác định các giá trị đo được y theo nồng độ x (lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình). Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương trình: y = ax + b.
Trong đó: a là giá trị slope (độ dốc)
b là giá trị intercept (hệ số chặn) và hệ số tương quan R.
2.3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ):
-Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.
Để xác định giới hạn phát hiện dựa trên độ lệch chuẩn, tiến hành làm trên nền mẫu thử. Làm 10 lần song song, thêm chuẩn ở nồng độ 5 ng/ml (gấp 5 lần LOD ước lượng, LOD ước lượng của máy là: 1 ng/ml). Thực hiện tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã tối ưu hóa ở trên. Phân tích mẫu 10 lần lặp lại, tính giá trị trung bình Xtb và độ lệch chuẩn SD
Tính LOD: Tính giá trị nồng độ trung bình Xtb , độ lệch chuẩn SD LOD = 3 x SD
= ∑( − )
−1
Để đánh giá LOD đã tính được ta kiểm tra qua giá trị F= Xtb/LOD
Đánh giá LOD, thỏa mãn: 4≤ F ≤10 nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy.
- Giới hạn định lượng(LOQ): Là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
LOQ=10 x SD
2.3.3.4. Độ chính xác (độ chụm và độ đúng)
Độ chụm: Trong nhiều trường hợp các phép thử nghiệm trên những đối tượng với những điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau. Điều này do các sai số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, ta không thể kiểm soát được các sai số này, phải dùng đến khái niệm độ chụm. Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực. Độ chụm chỉ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình. Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên càng lớn.
Cách xác định: Tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng (mẫu cà phê bột đã được phân tích không chứa Ocharatoxin A) thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau cụ thể thêm chuẩn ở 3 mức là 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml. Phân tích các mẫu thêm chuẩn đó (mỗi mức làm lặp lại 6 lần, mỗi lần bắt đầu từ cân). Tính độ lệch chuẩn SD hay hệ số biến thiên CV theo công thức:
% = % = 100
Trong đó:
SD: Độ lệch chuẩn n: Số lần thí nghiệm
xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i” x: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm RSD %: Độ lệch chuẩn tương đối
Độ đúng của phương pháp: Là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.
Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng (gọi chung là giá trị đúng)
Độ đúng là khái niệm định tính và được biểu diễn định lượng dưới dạng độ chệch (Bias) hoặc hiệu suất thu hồi (recovery).
∆=x−µ
µ 100
Trong đó:
∆: Độ chệch (bias), %
x: Giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm µ: Giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng
Xác định hiệu suất thu hồi: Tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng (mẫu cà phê bột đã được phân tích không phát hiện Ocharatoxin A) thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau cụ thể thêm chuẩn hỗn hợp ở 3 mức là 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml. Phân tích các mẫu thêm chuẩn đó (mỗi mức làm lặp lại 6 lần). Tính hiệu suất thu hồi đối với mẫu trắng theo công thức:
H% = Ctt 100
Trong đó:
H%: Hiệu suất thu hồi, %
Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn Cc: Nồng độ thêm chuẩn (lý thuyết)
Sau đó tính hiệu suất thu hồi chung là trung bình của hiệu suất thu hồi các lần làm lặp lại.
Thêm chuẩn ở ba mức nồng độ là mức thấp, trung bình và cao trong khoảng nồng độ làm việc. Theo quy định của Hội đồng Châu Âu đối với các chỉ tiêu an toàn (các chỉ tiêu thuộc nhóm độc, có quy định giới hạn cho phép) thêm chuẩn vào mẫu trắng ở ba mức nồng độ tại 0,5 lần, 1 lần và 2 lần giới hạn cho phép (MRL).
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) tính theo diện tích peak sắc kí của 03 lần thực hiện riêng biệt trên cùng một nồng độ phải nhỏ hơn 10 %.
• Nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm được tính theo công thức chung như sau:
X =
C0×1
m, (V )
Trong đó
-X: nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm, μg/kg hoặc μg/L
-
Co: nồng độ chất cần phân tích tính từ đường chuẩn, μg/L
-
1: Thể tích định mức 1 mL, (mL)
-m: khối lượng mẫu phân tích, (g) hoặc (V) thể tích mẫu phân tích, (mL)
2.3.3.5. Giới hạn lặp lại (r), giới hạn tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm (R)
Độ lặp lại: Đánh giá mức độ biến động của kết quả thử nghiệm được thực hiện bởi cùng một người trong cùng phòng thử nghiệm. Đánh giá độ lặp lại của phép thử thường thực hiện trên mẫu trắng thêm chuẩn vào ở 3 ngưỡng nồng độ 1x, 1,5x, 2x MRL, mỗi nồng độ được kiểm nghiệm lăp lại 6 lần. Tiêu chí đánh giá là hệ số biến thiên (CV%) theo quy đinh trong quyết định 657/2002/EC.
Độ chụm trung gian (SR): Độ chụm trung gian diễn tả mức độ biến động trong phạm vi phòng thử nghiệm thực hiện trong các ngày khác nhau. Tuy nhiên, không cần thiết nghiên cứu riêng rẽ sự ảnh hưởng của từng nhân tố. Để đánh giá độ chụm trung gian của phép thử, phép thử được thực hiện trên mẫu trắng thêm chất chuẩn ở 3 nồng độ khác nhau (1x, 1,5x, 2x MRL), mỗi nồng độ được kiểm nghiệm 6 lần, thực hiện 3 ngày khác nhau. Tính hệ số biến thiên (CV%) chụm ở mỗi nồng độ phân tích; Tiêu chí đánh giá là hệ số biến thiên (CV%) theo quy định trong quyết định 657/2002/EC.