3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu
3.4. Chọn quy trình xử lý mẫu
Sau khi khảo sát sơ bộ trên 3 quy trình xử lý mẫu (mỗi quy trình tiến hành làm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình), cho kết quả như sau:
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu
Quy trình C thêm chuẩn,
ng/ml Kết quả Ochratoxin A 1 5 C (ng/ml) 2,2 H (%) 44 2 5 C (ng/ml) 3,1 H (%) 62 3 5 C (ng/ml) 4,1 H(%) 82
Nhận xét: Từ kết quả thu được ta nhận thấy quy trình 3 cho hiệu suất thu hồi là tốt nhất trong 3 quy trình khảo sát. Nếu chỉ chiết mẫu bằng NaHCO3 thì dịch chiết thu được rất đục làm ảnh hưởng đến quá trình qua cột và dịch chiết khi qua cột không loại được hết màu. Điều này vừa làm mất nhiều thời gian chiết vừa làm giảm hiệu suất của cột chiết. Trong khi đó chiết mẫu bằng ACN: H2O cũng không cho hiệu suất chiết cao. Do đó Tôi chọn khảo sát các điều kiện của quy trình 3 để đưa ra quy trình xử lý mẫu tối ưu nhất.
Quy trình xử lý mẫu tối ưu như sau:
Cân 12,5 g phần mẫu thử của mẫu cả phê rang xay, cho vào bình nón 250 ml. Thêm 100 ml dung môi chiết (50 ml MeOH, 50ml NaHCO3 3%). Đậy nắp lắc xoáy/ siêu âm ở tốc độ cao trong 5 phút. Lọc dịch chiết qua giấy lọc. Dùng pipet lấy 4 ml dịch chiết qua giấy lọc cho vào cốc thủy tinh có mỏ và thêm 96 ml PBS rồi đồng hóa.
Làm sạch bằng cột Ocha Test WB:
Để cho cột ái lực miễn nhiễm đạt đến nhiệt độ phòng, rồi nối với ống hút chân không gắn cột với bộ chiết pha rắn, loại bỏ dung dịch hoạt hóa có sẵn của cột, không được để khô cột. Gắn xylanh dung tích 60ml, sử dụng 2 phần mỗi phần khoảng 50 ml của dịch chiết mẫu đã pha loãng thu được .Cho dịch chiết pha loãng này đi qua cột Ocha Test WB ở tốc độ khoảng 1-2 giọt/ giây cho đến khi còn khoảng 10 ml trên ống xylanh cột. Cho 50ml dịch chiết còn lại qua cột. Không để tốc độ dòng vượt quá 3 ml/min và không để cột chảy đến khô.
Rửa tạp:
Rửa cột bằng 3 ml nước cất, tốc độ dòng tối đa 1-2 giọt/giây, sau đó rửa tiếp bằng 7 ml nước cất. Nhẹ nhàng thổi không khí bằng bơm chân không qua cột để loại bỏ chất lỏng còn lại.
Rửa giải:
Thêm metanol 3,0 ml cho qua cột. Đặt một ống thủy tinh dưới cột và cho phép cột rửa giải bằng áp lực trọng lực. Khi 1 - 2 ml metanol đã đi qua cột, thêm 1,0 ml metanol cho qua cột. Tổng cộng 4 ml metanol được sử dụng để rửa giải cột. Nhẹ nhàng thổi không khí bằng bơm chân không qua cột để loại bỏ bất kỳ methanol còn lại.
Đem dịch rửa giải đi thôi khô và hòa tan lại bằng 0,5 ml metanol, cho vào lọ (vial) 1m rồi đem đi phân tích LC MS/MS.
Tính kết quả, công thức sau:
1000 1 1000 2 1 4 3 x m x V V x V V x m w s a OTA
ma: Khối lượng Ochratoxin A trong phần dịch lỏng của dung dịch thử nghiệm được bơm lên cột, tính bằng nanogram (ng);
V4: Thể tích phần dịch lỏng của dung dịch thử nghiệm đã được bơm lên cột, tính bằng mililit (ml);
V3: Thể tích dung dịch thử , (V3 = 0,5 ml), tính bằng mililit (ml);
V2: Thể tích dịch lọc của mẫu được lấy để làm sạch, V2 = 10 ml, tính bằng mililit (ml);
V1: Thể tích của dung môi chiết, (V1 = 4 ml), tính bằng mililit (ml); ms: Khối lượng của mẫu đã chiết, (ms = 12,5 g), tính bằng gam (g);
Đọc từ đường chuẩn hàm lượng Ochratoxin A, có trong phần dịch lỏng của dung dịch thử nghiệm được bơm lên cột HPLC, tính bằng nanogam.
Tính nồng độ khối lượng của Ochratoxin A, W OTA, bằng microgam trên kilogam (µg/kg), dùng công thức trên.
Biểu thị kết quả cuối cùng bằng microgam trên kilogam vì đơn vị đo này cũng tương đương với nanogam trên gam.
Quy trình xử lý mẫu tối ưu được mô tả tóm tắt theo sơ đồ sau: