Trong nước, cho đến năm 2005, β-glucan được nghiên cứu sản xuất chủ yếu từ nấm lớn và chưa đem lại kết quả khả quan [12].
Năm 2005, tác giả Phạm Việt Cường đã đưa ra công nghệ sản xuất β- glucan từ thành tế bào men bánh mì [12]. Đề tài này đã tiến hành sản xuất - glucan thấp nhất 80%, dùng cho dược phẩm và mỹ phẩm, và để tinh sạch - glucan đã phải sử dụng cồn tuyệt đối và diethyleter (trang 32 của báo cáo tổng hợp [12]), trong đó rửa bằng cồn tuyệt đối phải ly tâm ở 40C, là một khó khăn về điều kiện sản xuất, tiếp theo rửa -glucan bằng diethyleter. Theo bảng dữ liệu độ an toàn vật liệu (Material Safety Data Sheet) của diethyl ether: khi nuốt, cho dù chỉ một lượng nhỏ chất Diethyl ether cũng có thể gây mù. Tiếp xúc lặp lại qua hít thở hoặc ngấm qua da có thể gây ngộ độc, rối loạn não, tổn thương thị lực và mù. Hít phải khí diethyl ether có thể làm trầm trọng thêm tình trạng sức khỏe ví dụ bệnh khí thủng và bệnh viêm cuống phổi..., trong khi đó đây là công đoạn cuối cùng, diethyl ether trực tiếp tiếp xúc với sản phẩm sau cùng, việc diethyl ether lưu lại trên sản phẩm rất khó tránh khỏi.
Thực tế trong báo cáo tổng hợp đề tài, phổ HNMR của các sản phẩm β- glucan do đề tài tách chiết ra (trang 36, 37 của báo cáo tổng kết [12]), đều có peak có độ dịch chuyển hóa học tại khoảng gần 1 ppm, đây là tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm methyl (có trong cả ethanol và diethyl ether), không thể có tín hiệu này gán cho bất kỳ proton nào của glucan. Như vậy, vẫn còn một ít yếu tố tồn tại cần phải tiếp tục giải quyết đối với công trình đã nghiên cứu về -glucan của Việt Nam.
Năm 2010 cũng chính tác giả đã thực hiện dự án tách chiết β-glucan tuy nhiên sản phẩm dự án thu được -glucan hỗn hợp với acid amin nên hàm lượng rất thấp. Như vậy, công nghệ sản xuất -glucan với qui mô lớn độ tinh sạch cao
Nhóm tác giả Lê Mai Hương và Trần Thị Hồng Hà đã nghiên cứu tách chiết polysaccharide giàu β-glucan khó tan từ nấm Hầu thủ và nấm Hương, sau đó thủy phân để có được hợp chất dễ tan hơn.
1.4.2.1. Sulfate hóa polysaccharide
Sulfate hóa polysaccharide từ rong nâu tạo thành sản phẩm oversulfated fucoidan được nhóm tác giả của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang hoàn thành vào năm 2014, đã sản xuất lượng lớn và đưa ra thành sản phẩm lưu hành trên thị trường.
Ngoài ra chưa có sản phẩm hoặc đề tài nào khác được công bố.
Các phương pháp tách chiết β-glucan từ men bánh mì và sulfate hóa β- glucan.
Cho đến nay, đã có nhiều qui trình công nghệ sản xuất β-glucan từ nấm men Saccharomyces cerevisiae, hầu hết các qui trình bao gồm 2 bước:
Bước 1: cho nấm men tự phân bằng các enzyme có sẵn trong tế bào, thành tế bào sau khi từ phân sẽ tách rới ra dưới dạng không tan, chứa β-glucan, mannoprotein và một ít chitosan.
Bước 2: tách β-glucan ra khỏi thành tế bào bằng hóa chất, enzyme hoặc các phương pháp vật lý như siêu âm, áp suất cao...
Việt Nam cũng đã có dự án sản xuất thử nghiệm KC.04.DA.04/06-10, dự án sản xuất thử nghiệm 2013-2014 của Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, tuy nhiên cả hai cũng đều thực hiện tách chiết β-glucan như các công bố trên thế giới đã nêu.
Toàn bộ các qui trình tách chiết β-glucan đã công bố đều tách lấy phần “tạp chất” ra khỏi màn tế bào nấm men, phần rắn không tan sau cùng là β- glucan, phương pháp này không thể làm sạch triệt để các thành phần khác β- glucan trong nấm men, đồng thời tốn thời gian rất dài cho nhiều phản ứng liên tiếp.
Các phương pháp đã nêu nhìn chung đều sản xuất được β-glucan thương phẩm nhưng chỉ dừng lại ở hiệu suất khoảng 80% do các phương pháp chủ yếu
tách bỏ các phần tan được trong nước của nấm men, sản phẩm còn lại là β- glucan nên không thể sạch hết được lượng protein (báo cáo tổng hợp đề tài
“Nghiên cứu qui trình công nghệ tổng hợp sulfate β-glucan từ nấm men bánh mì nhằm tạo nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư” [1]).
Để thu được β-glucan có độ tinh sạch cao hơn, chúng tôi tiến hành tách chiết β-glucan từ nấm men bằng chất lỏng ion [BMIM]Cl, theo phương pháp mới được đề xuất từ báo cáo tổng hợp đề tài: “Nghiên cứu qui trình công nghệ tổng hợp sulfate β-glucan từ nấm men bánh mì nhằm tạo nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư” [1].
Trong nghiên cứu trên, tác giả đã tách và định lượng β-glucan từ nấm men bánh mì bằng phương pháp như sau:
Theo phương pháp của Barry trên tạp chí Journal of AOAC International năm 2016 về phương pháp định lượng β-glucan trong nấm và các chế phẩm từ nấm men [72]. Đây là phương pháp sử dụng β-glucan assay kit, dùng xác định β-glucan từ nấm men trong hầu hết các công bố trên thế giới, gồm 3 bước: a) Tách α-glucan/glycogen trong mẫu bằng KOH 2M trong nước đá lạnh. Loại
bỏ cặn không tan, thủy phân bằng amylase, định lượng glucose (glucose α- glucan).
b) Thủy phân toàn bộ mẫu bằng H2SO4 12M (12 M H2SO4, 0°C, 2 giờ) sau đó 1M (1M H2SO4, 100°C), trung hòa bằng KOH 10M. Trong đó sẽ còn lại laminarisaccharide (1-7 phân tử glucose, lượng không đáng kể), tiếp tục thủy phân laminarisaccharide bằng exo-(1,3)-β-glucanase và β-glucosidase thành glucose. Tuy nhiên nếu thời gian thủy phân ở 1000C kéo dài 120 phút thì có hoặc không có bổ sung enzyme, lượng đường glucose sau thủy phân như nhau. Định lượng đường đơn bằng glucose oxidase/peroxidase reagent (glucose tổng số).
c) glucose β-glucan = (glucose tổng số - glucose α-glucan).
dimethylfoxmamide/sulfur trioxide-trimethylamine, chlorosulfonic acid– pyridine, sulfuric acid/dicyclohexyl carbodiimide, DMSO/CaSO4 khan/H2SO4 và hệ DMSO-pyrosulfate.
Tuy nhiên, để tiến hành sulfate hóa theo hệ tác chất ít độc nhất theo chúng tôi đã tiến hành tra cứu độc tính cấp qua đường uống của các dung môi, kết quả thu được cho thấy thực hiện sulfate hóa với DMSO là an toàn nhất.
Do đó phương pháp sulfate hóa β-glucan của đề tài sẽ thực hiện theo qui trình sử dụng dung môi DMSO và tác nhân sulfate hóa là sodium pyrosulfate.
Hàm lượng sulfate trong sulfate β-glucan thu được sau khi sulfate hóa β- glucan được xác định bằng phương pháp chuẩn độ với cetyl pyridium chloride của Scott công bố trong tạp chí Methods in Plant Biochemistry [73].
Bảng 1.4. Liều gây chết trung bình của một số dung môi
Dung môi Pyridine Chlorosulfonic DMF DMSO LD50 [74] 891 mg/kg 50 mg/kg 2.800 mg/kg 14.500 mg/kg Hàm lượng sulfate β-glucan được tính bằng tổng hàm lượng β-glucan và hàm lượng sulfate.