sản phẩm thu được từ sulfate hóa nấm men.
Trên cơ sở phương pháp của Barry được công bố trên tạp chí Journal of AOAC năm 2016 [72]. Tôi đã tiến hành định lượng β-glucan như sau:
a) Tách α-glucan/glycogen trong mẫu bằng KOH 2 M trong nước đá lạnh. Ly tâm loại bỏ dịch thủy phân.
b) Tiếp tục thủy phân mẫu bằng H2SO4 12 M (12 M H2SO4, 0°C, 2 giờ) sau đó 1 M (1 M H2SO4, 100°C, 2 giờ), trung hòa bằng KOH 1 M.
c) Định lượng đường đơn bằng phương pháp chuẩn độ ferricyanide theo phương pháp của tác giả Hanes CS [75].
Chi tiết qui trình kiểm: Tách loại α-glucan:
Cân chính xác lần lượt 100 mg β-glucan chuẩn sigma vào ống ly tâm 15 mL, 400 mg men bánh mì, 100 mg β-glucan luận văn và 100 mg sản phẩm sulfate β-glucan vào 3 ống ly tâm 15 mL khác, gõ ống để bảo đảm toàn bộ mẫu rơi xuống đáy ống. 4 mL KOH 2 M đựng trong chai ngâm trong nước đá lạnh được thêm vào mỗi ống, đặt ống ly tâm 15 mL trong ống ly tâm 50 mL có chứa nước đá lạnh, rung trên vortex trong 20 phút để hòa tan α-glucan/glycogen.
Ly tâm loại bỏ dung dịch. Thêm vào đó 2 mL nước cất lạnh (để lạnh cùng với KOH 2 M), rung trên vortex 10 phút để rửa kết tủa β-glucan, ly tâm bỏ dịch rửa, rửa lặp lại 3 lần.
2,0 mL acid sulfuric 12 M lạnh ngâm bình chứa acid trong nước đá được thêm vào mỗi ống, và các ống được đậy nắp và khuấy trên máy trộn xoáy. Các ống được đặt trong một bể nước đá và để trong 2 giờ. Thỉnh thoảng, đem khuấy mạnh trên máy trộn xoáy để đảm bảo hòa tan và phân tán mẫu hoàn toàn. 10 mL nước được thêm vào mỗi ống, và các ống được đậy nắp và khuấy mạnh trên máy trộn xoáy trong 10 giây.
Chuyển mỗi ống ly tâm sang ống thủy tinh, có nắp vặn, rửa tiếp ống ly tâm 2 lần mỗi lần 1mL nước (tổng cộng thêm vào ống ly tâm 12 mL nước), các ống được đặt trong bể nước sau đó nấu sôi. Sau 5 phút, các nắp được siết chặt và đun tiếp tục ở 100°C trong 2 giờ. Sau đó, các ống được làm mát đến nhiệt độ phòng. Trung hòa bằng KOH 1M
Xác định đường đơn:
Tiếp theo dịch thủy phân được xác định đường đơn theo Hanes CS: dịch thủy phân được thêm 3 giọt methyl đỏ và trung hòa từ từ bằng KOH 5% cho đến khi xuất hiện màu vàng nhạt.
Sau đó cho hết hỗn hợp vào bình định mức 500 mL định mức tới vạch và lắc đều, lọc bỏ kết tủa. Thu được 4 bình định mức chứa 500mL dung dịch đường khử sau thủy phân của β-glucan chuẩn, nấm men bánh mì và sulfate β- glucan. Cho 4 dịch chứa đường khử của 4 bình định mức vào 4 burette, mỗi bình 1 burette riêng biệt.
Cho vào 4 bình tam giác 250 mL, mỗi bình 5,0 mL dung dịch K3[Fe(CN)6] 1% và 2,5 mL dung dịch NaOH 2,5 N.
Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch từ các burette chứa đường khử của β-glucan chuẩn, men bánh mì và β-glucan sulfat, cho từng giọt một lắc mạnh. Dung dịch ban đầu có màu vàng chanh của ferricyanide. Điểm dừng chuẩn độ xác định khi màu vàng chanh biến mất, dung dịch trong suốt không màu khoảng 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rơm rất nhạt của ferrocyanide.
Chuẩn độ 5,0 mL dung dịch K3[Fe(CN)6] 1% đến điểm tương đương, tiêu tốn hết V0, V1, V2, V3 mL dung dịch β-glucan chuẩn, men bánh mì và sulfate β-glucan.
Phản ứng xảy ra:
C6H12O6 + 2K3[Fe(CN)6] + 3NaOHC6H11O7Na + 2NaK3[Fe(CN)6] + 2H2O Hàm lượng β-glucan có trong men bánh mì:
Gm = 0,98 × (V0/4V1) × 100%.
Hàm lượng β-glucan có trong sản phẩm β-glucan luận văn: GGL = 0,98 × (V0/V2) × 100%.
Hàm lượng β-glucan có trong mẫu sản phẩm sulfate β-glucan: GSG = 0,98 × (V0/V3) × 100%.