Hiệu suất sulfate hóa được tính theo 2 cách: a. Hiệu suất tính theo khối lượng:
H1% = mBG(SG)
mBG(men) x 100% = GSGxMSG
GmxMm x 100%
Với: mBG(SG) là khối lượng β-glucan có trong sản phẩm sulfate β-glucan thu được từ 1 kg men bánh mì.
mBG(men) là khối lượng β-glucan có trong 1 kg nguyên liệu men bánh mì MSG và GSG: khối lượng β-glucan trong sản phẩm sulfate β-glucan thu được
Mm và Gm: khối lượng β-glucan có trong men bánh mì ban đầu.
Trong đó hàm lượng β-glucan trong men bánh mì và trong sản phẩm sulfate β-glucan được xác định bằng phương pháp của Barry (AOAC, 2016).
Gọi y, x lần lượt là số mol –SO3Na và số mol glucose có trong 1 gam sản phẩm sulfate β-glucan.
Hiệu suất sulfate hóa theo số mol xác định như sau: H2% = y/x
Trong đó: y tính từ phản ứng chuẩn độ sulfate bằng CPC, biết y có thể tính theo x từ phương trình: 180x + 103y – 18x – y = 1 hay 162x – 102y = 1. 2.3. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC SẢN PHẨM
2.3.1. Xác định β-glucan
Căn cứ cơ sở dữ liệu phổ HSQC từ công bố trên Data in Brief [76] (hình 2.1). Các tín hiệu của (1→3)β-glucan được thể hiện trên phổ là các tín hiệu của gốc glucose B1 và B2, được đánh dấu bằng các vòng tròn.
Đây là các tín hiệu tương ứng cả HNMR, CNMR và tương tác CH, vì vậy, khi đo phổ HSQC cua sản phẩm, nếu có chứa các tín hiệu này chúng tỏ có (1→3)β-glucan.
Sản phẩm sau khi tách chiết từ men bánh mì sẽ được ghi phổ HSQC, nếu phổ thu được của sản phẩm có các tín hiệu cộng hưởng tương ứng cả về phổ HNMR và CNMR đồng thời các tương tác C-H tương ứng trong phổ HSQC với phổ mẫu của đoạn mạch B1, B2 thì sản phẩm là (1→3)β-glucan.
2.2.2. Xác định cấu trúc sulfate β-glucan:
a. Dựa vào phổ IR
Theo công bố trên tạp chí Agricultural and Food Chemistry năm 2006, trong đó có phổ của sulfate β-glucan được điều chế từ yến mạch [50]. Phổ IR của sản phẩm sulfate hóa từ glucan tín hiệu dao động tại 1248 cm-1 và 810 cm- 1 chứng tỏ glucan đã được sulfate hóa. Đây cũng là công bố của tác giả Gabrielle C. Calegari, trên tạp chí Pharmacy and Pharmacology số 5 năm 2017 [77].
Hình 2.4. Phổ FT-IR của sulfate β-glucan [77].
Một công bố khác, 1111 và 804 cm-1, cũng là tín hiệu chứng tỏ có sulfate glucan đó là của tác giả M. Wang và các cộng sự được đăng trên tạp chí Biological Macromolecules 70 năm 2014 [78].
Hình 2.5. Phổ FT-IR của sulfate β-glucan [78]. b. Dựa vào phổ NMR
Tác giả Zhongwei Sun và các cộng sự trên công bố trên tạp chí Carbohydrate Polymers 77 năm 2009 [79], khẳng định phổ CNMR của sulfate β-glucan so với β-glucan sẽ xuất hiện thêm các peak mới về phía trường thấp (downfield) C4 (69,5 ppm) dịch chuyển đến C4-S (75,7 ppm), C2 (73,6 ppm dịch chuyển đến 79,8 ppm), do đã xảy ra sulfate hóa thế nhóm SO4 vào vị trí nhóm OH.
Hình 2.6. Phổ CNMR sản phẩm sulfate hóa S-RVS3-II, glucan RVS3-II [79] Đây là căn cứ có thể dựa vào để khẳng định β-glucan đã được sulfate
tương tác C-H thể hiện trên phổ HSQC, carbon không có liên kết với hydro nào, trong cấu trúc sulfate β-glucan không có dạng carbon này, hoặc đó chỉ là tín hiệu nhiễu.
Do đó, cần thiết phải kiểm tra trên phổ HSQC, nếu trên phổ HSQC của sản phẩm có thể hiện sự thay đổi do chuyển dịch về phía trường thấp tương ứng về cả CNMR và HNMR thì β-glucan đã được sulfate hóa. Trong đó, tại vị trí carbon nào có tín hiệu dịch chuyển về phía trường thấp thì tại vị trí đó, nhóm hydroxyl đã được thay thế bằng nhóm sulfate.
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT β-LUCAN VÀ TỔNG HỢP SULFATE β-GLUCAN TỪ MEN BÁNH MÌ. GLUCAN TỪ MEN BÁNH MÌ.
Sau khi tiến hành nhiều lần thí nghiệm tôi chọn nhiệt độ 80oC và thời gian khuấy 2 giờ thuận tiện cho việc sản xuất quy mô công nghiệp. Ở nhiệt độ trên nước không bị bay hơi tăng thời gian sử dụng của motor khuấy, hạn chế hư hỏng.
Tỉ lệ men bánh mì (β-glucan) : Na2S2O7, dựa trên phản ứng: R-OH + Na2S2O7 → ROSO3H + Na2SO4
Khối lượng phân tử của 1 đơn vị glucose trong mạch glucan là 180 – 18 = 162 (mỗi gốc liên kết đường mất đi 1 hydro và một nhóm hydroxyl), của Na2S2O7 là 222, 1 phân tử đường thế một gốc sulfate khối lượng tương ứng là 162:222, nếu thế được 2 gốc sẽ là 162:444, đồng thời trong quá trình sulfate hóa Na2S2O7 tan ra dần theo lượng nước được sinh ra từ phản ứng chứ không tan hết một lần, dựa theo tính toán và thực tế thí nghiệm khi quan sát lượng Na2S2O7 không tan hết, tỉ lệ men bánh mì (β-glucan) : Na2S2O7 được chọn là 1:3.
Tỉ lệ men bánh mì (β-glucan) : DMSO:
Tỉ lệ β-glucan : DMSO được chọn là 1 : 10, như sơ đồ đã thỏa mãn điều kiện phản ứng hết men bánh mì (β-glucan) trong quá trình phản ứng như kết quả trong báo cáo tổng hợp của TS. Nguyễn Duy Nhứt [1] vì vậy, không cần thiết phải tăng thêm DMSO vì đây là dung môi đắt tiền, giảm DMSO hỗn hợp đặc sệt lại, khó khăn cho khuấy trộn và phản ứng diễn ra.
Đối với quy trình tách chiết β-glucan tôi thực hiện theo “Quy trình điều chế β-glucan từ men bánh mì bằng chất lỏng ion” đã được TS. Nguyễn Duy Nhứt đăng trên công báo sở hữu công nghiệp số 368A, tháng 11/2018. Thực hiện quy trình này song song với phương pháp sulfate hóa trực tiếp để đối chứng hàm lượng β-glucan có trong men bánh mì với sản phẩm thu được, tính
3.1.1. Xác định β-glucan từ nấm men, β-glucan luận văn, sulfate β-glucan. glucan.
Để xác định hàm lượng β-glucan trong các sản phẩm luận văn, tôi tiến hành chuẩn độ 5 mL dung dịch K3Fe(CN)6 1% đến điểm tương đương, tiêu tốn hết V0, V1, V2, V3 mL dung dịch β-glucan chuẩn, men bánh mì và sulfate β- glucan, các số liệu thu thập được ghi trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng β-glucan các mẫu kiểm STT Mẫu thử Thể tích (mL) dịch đường khử tiêu tốn
cho chuẩn độ 5 mL K3Fe(CN)6 1%
Hàm lượng β-glucan 1 β-glucan chuẩn 14,80 14,60 14,60 Trung bình V0 = 14,67 ± 0,12 98,00% 2 β-glucan từ men bánh mì 25,20 25,40 25,40 Trung bình V1 = 25,33 ± 0,12 14,19% 3 β-glucan luận văn 15,00 14,80 14,80 Trung bình V2 = 14,87 ± 0,12 96,68%
4 Sulfate β-
glucan 17,60
17,80 17,60
Trung bình V3 = 17,69 ± 0,12 81,27%
Hàm lượng β-glucan có trong men bánh mì (tách chiết):
Gm = 0,98 × (V0/4V1) × 100% = 98 × (14,67/4×25,33) × 100% = 14,19%. Hàm lượng β-glucan có trong β-glucan luận văn:
GGL = 0,98 × (V0/V2) × 100% = 98 × (14,67/14,87) × 100%= 96,68%. Hàm lượng β-glucan có trong mẫu sulfate β-glucan:
GSG = 0,98 × (V0/V3) × 100% = 98 × (14,67/17,69) × 100%= 81,27% Để kiểm chứng lại sản phẩm có phải là β-glucan, tôi tiến hành so sánh phổ hồng ngoại của sản phẩm và chất chuẩn.
Hình 3.2. Phổ hồng ngoại của β-glucan tách chiết (B)
Đặc trưng cấu trúc sản phẩm β-glucan tách chiết được khảo sát bằng phổ hồng ngoại và so sánh với phổ hồng ngoại của β-glucan chuẩn. Kết quả từ hình 3.2 và 3.3 cho thấy các đỉnh chính xuất hiện từ 400-4000 cm-1 và được liệt kê ở bảng 3.2 cho thấy đỉnh xuất hiện ở 3437 cm-1 thuộc liên kết O-H xuất có cường độ cao và vai rộng, đỉnh 2922 cm-1 có cường độ trung bình và vai hẹp cùng với đỉnh có cường độ yếu ở khoảng 2088 cm-1 điều thuộc liên kết C-H. Các đỉnh tại số sóng 1641 và 1072 cm-1 là đặc trưng của liên kết CO. Trong khi đó các đặc trưng của liên kết CCH, C-O-C và CC được biểu hiện ở các đỉnh tương ứng là 1240, 1152 và 880 cm-1.
Phổ hồng ngoại của β-glucan chuẩn (A) và của β-glucan tách chiết (B) trên hình 3.2 và hình 3.3 cho thấy sau khi được tách chiết qua chất lỏng ion, protein trong men đã giảm đi rất mạnh (vùng tín hiệu tại 1662 và 1544) chứng tỏ đã loại bỏ được hầu hết protein, còn lại β-(1→3)-glucan với hấp thụ tại 1072 cm-1 và 880 cm-1, qua định lượng và định tính trên phổ IR chứng tỏ sản phẩm là β-(1→3)-glucan 96,68%.
Bảng 3.2. Các đỉnh của các nhóm chức đặc trưng cơ bản của β-glucan TT Đỉnh (cm-1) Nhóm chức TT Đỉnh (cm-1) Nhóm chức 1 3437 OH 5 1152 COC 2 2922 CH2 6 1072 CO 3 1641 CO 7 1035 CC 4 1240 CCH 8 880 CO của β-glucan
Mặt khác trong phổ NMR của sản phẩm β-glucan từ sản phẩm:
Các tín hiệu cộng hưởng trên phổ HSQC của β-glucan thu được từ phương pháp tách chiết bằng chất lỏng ion [BMIM]Cl, với các độ dịch chuyển hóa học của C1, C3, C5, C2, C4, C6 tương ứng với độ dịch chuyển 102,79 ppm; 86,09 ppm; 76,19 ppm; 72,59 ppm; 68,22 ppm; 60,70 ppm và H1, H6a, H3, H6b, H2, H5, H4 là 4,537 ppm; 3,729 ppm; 3,487 ppm; 3,473 ppm; 3,326 ppm; 3,311 ppm; 3,273 ppm. Hoàn toàn tương đồng với tín hiệu cộng hưởng phổ HSQC của β-(1→3)-glucan từ công bố trên (hình 2.3).
Các tín hiệu cộng hưởng tương ứng từ phổ HNMR và CNMR của mỗi tín hiệu tương tác C-H trên HSQC của β-glucan từ luận văn (hình 3.4) đều tương ứng từng cặp với phổ đã được công bố, chứng tỏ sản phẩm thu từ phương pháp tách chiết là β-glucan.
Ngoài các tín hiệu cộng hưởng này, trên phổ không có peak khác, chứng tỏ đây là β-glucan đạt độ tinh sạch rất cao, phù hợp với phân tích định lượng β- glucan đạt 96,68% (bảng 3.1).
C6-H6a C6-H6b
C3-H3 C4-H4
C2-H2
C5-H5
Hình 3.3. Phổ HSQC của β-glucan tách chiết. Bảng 3.3. Số liệu NMR của β-glucan tách chiết
Vị trí β-glucan tách chiết (DMSO-d6) Hợp chất so sánh β-glucan [76] (DMSO-d6) Loại cacbon δH (ppm) δC (ppm) δC (ppm) 1 -CH- 4,537 102,79 102,60 2 -CH- 3,326 72,59 72,78
3 -CH- 3,487 86,09 86,32
4 -CH- 3,273 68,22 68,12
5 -CH- 3,311 76,19 76,34
6 -CH2- 3,729 ; 3,473 60,70 60,52
3.1.2. Xác định hiệu suất chuyển hóa β-glucan từ men bánh mì thành sulfate β-glucan: thành sulfate β-glucan:
Qui trình sản xuất sulfate β-glucan từ hình 3.1, nguyên liệu đầu vào 1kg men bánh mì thu được 148,5g sulfate β-glucan, thực hiện các tính toán sau:
Hàm lượng β-glucan có trong 1kg men bánh mì: 1kg x 14,19% = 0,1419 kg = 141,90g.
Hàm lượng β-glucan sulfate có trong 148,5g sulfate β-glucan: 148,5g x 81,27% = 120,69g.
Hiệu suất chuyển hóa β-glucan từ men bánh mì thành sulfate β-glucan: H% = 100 x (120,69/141,90) = 85,05%.
Từ các phân tích và tính toán bên trên, hiệu suất chuyển hóa là 85,05%. 3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC SẢN PHẨM SULFATE β-GLUCAN
3.2.1. Hàm lượng sulfate
Kết quả chuẩn độ hàm lượng sulfate trong phân tử sulfate β-glucan được thể hiện trên bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hàm lượng sulfate của mẫu sulfate β-glucan thu được
STT Mẫu thử Thể tích (mL) dung dịch cetylpyridinium chloride 0,1 M Hàm lượng sulfate qui về SO3Na
2 sulfate β-glucan 19,30 19,88
3 sulfate β-glucan 18,50 19,06
Trung bình 18,90 ± 0,40 19,46% ± 0,41%
Xác định tỉ lệ mol sulfate trong sulfate β-glucan:
Gọi x, y là số mol glucose và sulfate có trong 1 gam mẫu, mỗi phân tử glucose trong glucan sau khi tạo liên kết mất đi 1 HOH, 1 nhóm SO3Na thế vào glucan mất đi 1H:
Khối lượng 1 gam mẫu: x180 + y103 – x18 – y = 1 = 162x + 102y (1). Số mol SO3Na trong 100 mL mẫu (có 1 gam mẫu) bằng số mol CPC tiêu tốn cho chuẩn độ 100 mL dung dịch mẫu:
y = 0,001 × V × 0,1 = 0,0001 × 18,9 = 0,00189. Hàm lượng sulfate qui về SO3Na của sản phẩm sulfate β-glucan:
100 × (0,0001V × 103)/1 = 100 × 0,0001V × 103 = 1,03 × 18,9 = 19,46%.
Số mol sulfate tính từ chuẩn độ cetylpyridinium chloride:
Với y = 18,9 × 0,0001 = 0,00189 thay vào phương trình (1). Ta thu được x = (1 – 102 × 0,00189)/162 = 0,00498.
Tỉ lệ x/y = 0,00498/0,00189 ≈ 2,6 ≈ 5 2.
Như vậy trong phân tử sulfate β-glucan, 5 gốc glucose sẽ có 2 nhóm thế SO3Na.
Tỉ lệ này phù hợp với diện tích tín hiệu tương tác trên phổ HSQC. Đồng thời đáp ứng được yêu cầu của luận văn là 15%. Tương thích với nghiên cứu đã được công bố như “Solubilization of water-insoluble β-glucan isolated from Ganoderma lucidum”. Man Deuk Han, Yeon Soo Han, Sung Hee Hyun, and Hyun Woung Shin. Journal of Environmental Biology March 2008, 29(2) 237- 242 (2008) [80]. Tỉ lệ mol sulfate so với gốc đường khoảng 1:3.
3.2.2. Phổ IR của sản phẩm sulfate β-glucan:
Ở 2 vị trí tín hiệu 3463,80 cm-1 và 1637,79 cm-1 (hình 3.5) tương ứng là dao động của nhóm poly-OH và CO. Các dao động của C-O nằm trong khoảng từ 1200 – 950 cm-1 cũng như ở vùng dị thường 950 – 750 cm-1 để phân biệt α- glucan với β-glucan, tương đồng với phổ hồng ngoại của β-glucan trong TLTK [81].
Trong phổ sản phẩm sulfate β-glucan thu được của luận văn không có tín hiệu dao động tại 841 cm-1, cho thấy không có thành phần α-glucan trong sản phẩm. Với các tín hiệu dao động tại 1057,43 cm-1 và 995,11 cm-1 (hình 3.5) thể hiện sản phẩm thu được là cấu hình β-glucan sau khi thực hiện sulfate hóa. Với 2 tín hiệu rõ ràng tại 1134,78 cm-1 là dao động của nhóm S=O và 810,55 cm-1 (hình 3.5) là dao động của nhóm C-O-S trong nhóm thế ester sulfate C-O-SO3 của phân tử sulfate β-glucan, gần với kết quả nghiên cứu của tác giả Wang [78], cũng được đề cập đến trong TLTK [82].
Như vậy với kết quả phổ IR thu được của sản phẩm β-glucan sulfate và β-glucan được biểu diễn tại hình 3.6, tín hiệu dao động tại vùng 1248 cm-1 và 810,5 cm-1 của phổ IR từ sulfate β-glucan so với phổ IR của β-glucan, chứng tỏ đã có xuất hiện nhóm thế sulfate thế vào nhóm hydroxyl của β-glucan.
Hình 3.5. Phổ IR của sulfate β-glucan (C).
Bảng 3.5. Các đỉnh của các nhóm chức đặc trưng của sulfate β-glucan TT Đỉnh (cm-1) Nhóm chức TT Đỉnh (cm-1) Nhóm chức
1 3463 OH 4 1134 S=O
2 1637 CO 5 810 C-O-S
3 1248 S=O
3.2.3 Phổ HSQC của sản phẩm β-glucan sulfate từ luận văn
Phổ NMR của β-glucan sulfate từ luận văn:
So sánh phổ CNMR của sulfate β-glucan (SG) và β-glucan (GL) (hình 3.6) các peak phổ trước và sau khi sulfate hóa đã có sự dịch chuyển về phía trường thấp (downfield) tương tự như công bố của Tác giả Zhongwei Sun và các cộng sự trên công bố Carbohydrate Polymers 77 (2009) 628–633 [79].
Tuy nhiên, với rất nhiều peak phổ xen kẽ nhau rất khó phân biệt sự biến đổi của từng peak phổ sau khi sulfate hóa. Vì vậy, để tường minh hơn, chúng ta cần xem xét trên phổ 2 chiều, dựa vào sự tương tác C-H trên phổ HSQC để phân biệt và giải thích sự biến đổi này.
Hình 3.6. Phổ CNMR của β-glucan (A) và sulfate β-glucan (B) từ luận văn Chuyển dịch tín hiệu phổ HSQC của sản phẩm β-glucan sulfate và β- glucan được biểu diễn tại hình 3.7.
Ta có thể nhận thấy rất rõ tín hiệu dịch chuyển trên phổ CNMR, cũng như HNMR tương ứng. Tuy nhiên như đã phân tích, chỉ tín hiệu dịch chuyển thể hiện trên phổ HSQC mới có giá trị thực sự, cũng từ các kết quả đã nêu, nhóm sulfate đã có mặt ở vị trí C4 hoặc C2 của β-glucan. Ta không xem xét C3, C5 vì tại đó không có nhóm OH. Các tín hiệu rất nhỏ do chuyển dịch của C3 và C6 có thể do một phần rất nhỏ OH tại C6 đã sulfate hóa, và OH của C3 trong các phân tử glucose không liên kết tạo thành.
Bảng 3.6. Độ dịch chuyển của carbon có nhóm thế sulfate
Vị trí carbon β-glucan Vị trí carbon sulfate β-glucan
C4 68,22 ppm C4-S 73,33 ppm