Bảng 2.2. Một số dụng cụ/thiết bị sử dụng chính trong luận văn
STT Dụng cụ/thiết bị Loại/model Xuất xứ
1 Ống ly tâm 15 mL, 50 mL Biologix - China
2 Bình tam giác 250 mL Biologix - China
3 Bình định mức 500 mL Biologix - China
4 Ống thủy tinh Biologix - China
5 Burette 50 mL Sigma – Mỹ
6 Máy vortex Jeio tech VM-96B Jeio – Hàn Quốc 7 Máy phổ cộng hưởng từ
hạt nhân
Brucker Advance
DPX Heaeus – Đức
8 Bể ổn nhiệt B12 Heaeus – Đức
9 Cân phân tích CP224S Satorius – Đức
10 Bộ siêu lọc UHP43 Nichiryo – Nhật
11 Các loại pipet 5 mL, 10 mL... Nichiryo – Nhật - Tất cả các dụng cụ sử dụng trong luận văn đều đạt hạng phân tích. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tách chiết chuẩn bị mẫu β-glucan từ men bánh mì
Để xác định được hiệu suất chuyển hóa từ phương pháp đề xuất của luận văn, tôi tiến hành tách chiết mẫu men bánh mì xác định hàm lượng β-glucan có trong men, làm cơ sở đối chứng với sản phẩm. Quy trình tinh chế được thực hiện bằng chất lỏng ion [BMIM]Cl như sau:
5 gam men bánh mì khô Saf-Viet®, trộn với 100 gam [BMIM]Cl, đun nóng khoảng 800C, khuấy liên tục, sau khoảng 15 phút, men bánh mì tan hoàn toàn trong chất lỏng ion [BMIM]Cl.
Dừng đun nóng, thêm 200 mL nước vào dung dịch, tiếp tục khuấy trong 10 phút nữa, toàn bộ các chất khác β-glucan trong men bánh mì đều tan trong dung dịch nước của [BMIM]Cl, riêng β-glucan tách ra dưới dạng kết tủa bông xốp.
Gạn lọc, rửa kết tủa bằng nước khoảng 3 lần sau đó rửa bằng ethanol 96% lập lại 3 lần nữa, thu kết tủa sấy ở 600C qua đêm thu được khoảng 0,7 gam β-glucan.
2.2.2. Sulfate hóa men bánh mì chuẩn bị mẫu sulfate β-glucan:
Chuẩn bị hỗn hợp gồm: 1 kg men bánh mì, 3 kg Na2S2O7, 10 lít DMSO, đun nóng hỗn hợp phản ứng ở 800C trong 2 giờ, khuấy liên tục.
Sau đó để nguội, trung hòa hỗn hợp bằng CaCO3, lượng CaCO3 dư nằm dưới dạng kết tủa, CaCO3 tham gia phản ứng tạo thành CaSO4 cũng dạng kết tủa, và tạo thành CO2 bay đi.
Lọc bỏ chất rắn gồm β-glucan chưa phản ứng, CaCO3, CaSO4,... thu dung dịch để thực hiện bước tiếp theo.
Thêm 10 lít ethanol 80%, thu kết tủa, rửa bằng ethanol khoảng 3 lần, kết tủa chủ yếu gồm sulfate β-glucan, Na2SO4, β-glucan chưa phản ứng và một ít chất khác, hòa tan lại kết tủa trong 20 lít nước. Lọc bỏ bã rắn, dung dịch cho chạy qua lọc rây phân tử 100-150 kDa đến thể tích còn khoảng 10 lít. Thêm 20 lít ethanol 80%, sulfate β-glucan tách ra ở dạng kết tủa, lọc, rửa kết tủa 3 lần bằng ethanol 96%, sấy khô qua đêm ở 600C thu được khoảng trên 148,5 gam.
1kg men bánh mì khô +3kg Na2S2O7 +10lít DMSO
800C, 2 giờ Sulfate β-glucan, Na2SO4, Na2S2O7, DMSO, các chất đã được sulfate hóa
khác …. 1,35 kg CaCO3
10 lít cồn 80% (v/v/) Ly tâm loại bỏ dịch
chứa cồn và DMSO Thêm 20 lít nước, lọc bỏ cặn, thu dịch trong Sulfate β-glucan, Na2SO4, các
chất đã được sulfate hóa khác,... Lọc rây phân tử 100-150 kDa, đến còn 10 lít
Thêm 20 lít ethanol 80%, ly tâm, tách lấy kết tủa, rửa lại bằng cồn 96%, sấy khô ở 60oC 148,5g Sulfate β-glucan 5g men bánh mì khô + 100g [BMIM]Cl 800C, 15 phút Dung dịch men bánh mì trong [BMIM]Cl Thêm 200 mL nước, khuấy trong 10 phút, ly tâm loại bỏ dịch, tiếp tục lập lại 3 lần nữa, lần sau cùng rửa bằng ethanol 96% (v/v), sấy khô ở 60oC 0,7g β-glucan
Hình 2.2. Qui trình điều chế sulfate β-glucan và β-glucan từ men bánh mì Cân
2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng sulfate trong sulfate β-glucan glucan
Phương pháp Scott cho đến nay là phương pháp duy nhất chuẩn độ định lượng nhóm sulfate và nhóm carboxylic trong phân tử anion polysaccharide. Được công bố trong tạp chí Methods in plant biochemistry năm 1990 [73].
Đây là phương pháp xác định chỉ có sulfate trong sulfate polysaccharide bằng cách kết tủa sulfated polysaccharide với cetylpyridiumchloride, cetylpyridiumchloride không tạo kết tủa với sulfate vô cơ có lẫn trong mẫu.
Qui trình chuẩn độ được thực hiện theo các bước như sau:
Khoảng 10 gam sulfate β-glucan được hòa tan vào nước cất, định mức đến 1 lít, lọc bỏ cặn, lấy 100 mL đem chuẩn độ với dung dịch cetyl pyridium chloride 0,1 M, dung dịch bị đục do xuất hiện kết tủa, chuẩn độ đến khi dung dịch đang đục đột ngột chuyển thành trong, kết tủa tách rời riêng biệt, tại thời điểm này, sulfate polysaccharide đã phản ứng hết với cetyl pyridium chloride.
Kết quả được tính theo số mol sulfate tác dụng với cetylpyridium chloride đã tiêu tốn trong chuẩn độ.
Số mol SO3Na trong 100 mL mẫu (có 1 gam mẫu) bằng số mol CPC tiêu tốn cho chuẩn độ 100 mL dung dịch mẫu:
0,001V x 0,1 = 0,0001V.
Hàm lượng sulfate qui về SO3Na của sản phẩm sulfate β-glucan: 100 x (0,0001V x 103)/1 = 100 x 0,0001V x 103 = 1,03V.
2.2.4. Phương pháp định lượng sulfate β-glucan:
sulfate β-glucan (b), loại trừ đi phân tử NaCl, hàm lượng sulfate β-glucan CSG% được tính:
a = 0,0001V(340-58,5) + b Từ đó
CSG% = 100 x b/1 = 100(a – 0,02815V)
2.2.5. Phương pháp định lượng β-glucan trong nấm men và mẫu sản phẩm thu được từ sulfate hóa nấm men. sản phẩm thu được từ sulfate hóa nấm men.
Trên cơ sở phương pháp của Barry được công bố trên tạp chí Journal of AOAC năm 2016 [72]. Tôi đã tiến hành định lượng β-glucan như sau:
a) Tách α-glucan/glycogen trong mẫu bằng KOH 2 M trong nước đá lạnh. Ly tâm loại bỏ dịch thủy phân.
b) Tiếp tục thủy phân mẫu bằng H2SO4 12 M (12 M H2SO4, 0°C, 2 giờ) sau đó 1 M (1 M H2SO4, 100°C, 2 giờ), trung hòa bằng KOH 1 M.
c) Định lượng đường đơn bằng phương pháp chuẩn độ ferricyanide theo phương pháp của tác giả Hanes CS [75].
Chi tiết qui trình kiểm: Tách loại α-glucan:
Cân chính xác lần lượt 100 mg β-glucan chuẩn sigma vào ống ly tâm 15 mL, 400 mg men bánh mì, 100 mg β-glucan luận văn và 100 mg sản phẩm sulfate β-glucan vào 3 ống ly tâm 15 mL khác, gõ ống để bảo đảm toàn bộ mẫu rơi xuống đáy ống. 4 mL KOH 2 M đựng trong chai ngâm trong nước đá lạnh được thêm vào mỗi ống, đặt ống ly tâm 15 mL trong ống ly tâm 50 mL có chứa nước đá lạnh, rung trên vortex trong 20 phút để hòa tan α-glucan/glycogen.
Ly tâm loại bỏ dung dịch. Thêm vào đó 2 mL nước cất lạnh (để lạnh cùng với KOH 2 M), rung trên vortex 10 phút để rửa kết tủa β-glucan, ly tâm bỏ dịch rửa, rửa lặp lại 3 lần.
2,0 mL acid sulfuric 12 M lạnh ngâm bình chứa acid trong nước đá được thêm vào mỗi ống, và các ống được đậy nắp và khuấy trên máy trộn xoáy. Các ống được đặt trong một bể nước đá và để trong 2 giờ. Thỉnh thoảng, đem khuấy mạnh trên máy trộn xoáy để đảm bảo hòa tan và phân tán mẫu hoàn toàn. 10 mL nước được thêm vào mỗi ống, và các ống được đậy nắp và khuấy mạnh trên máy trộn xoáy trong 10 giây.
Chuyển mỗi ống ly tâm sang ống thủy tinh, có nắp vặn, rửa tiếp ống ly tâm 2 lần mỗi lần 1mL nước (tổng cộng thêm vào ống ly tâm 12 mL nước), các ống được đặt trong bể nước sau đó nấu sôi. Sau 5 phút, các nắp được siết chặt và đun tiếp tục ở 100°C trong 2 giờ. Sau đó, các ống được làm mát đến nhiệt độ phòng. Trung hòa bằng KOH 1M
Xác định đường đơn:
Tiếp theo dịch thủy phân được xác định đường đơn theo Hanes CS: dịch thủy phân được thêm 3 giọt methyl đỏ và trung hòa từ từ bằng KOH 5% cho đến khi xuất hiện màu vàng nhạt.
Sau đó cho hết hỗn hợp vào bình định mức 500 mL định mức tới vạch và lắc đều, lọc bỏ kết tủa. Thu được 4 bình định mức chứa 500mL dung dịch đường khử sau thủy phân của β-glucan chuẩn, nấm men bánh mì và sulfate β- glucan. Cho 4 dịch chứa đường khử của 4 bình định mức vào 4 burette, mỗi bình 1 burette riêng biệt.
Cho vào 4 bình tam giác 250 mL, mỗi bình 5,0 mL dung dịch K3[Fe(CN)6] 1% và 2,5 mL dung dịch NaOH 2,5 N.
Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch từ các burette chứa đường khử của β-glucan chuẩn, men bánh mì và β-glucan sulfat, cho từng giọt một lắc mạnh. Dung dịch ban đầu có màu vàng chanh của ferricyanide. Điểm dừng chuẩn độ xác định khi màu vàng chanh biến mất, dung dịch trong suốt không màu khoảng 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rơm rất nhạt của ferrocyanide.
Chuẩn độ 5,0 mL dung dịch K3[Fe(CN)6] 1% đến điểm tương đương, tiêu tốn hết V0, V1, V2, V3 mL dung dịch β-glucan chuẩn, men bánh mì và sulfate β-glucan.
Phản ứng xảy ra:
C6H12O6 + 2K3[Fe(CN)6] + 3NaOHC6H11O7Na + 2NaK3[Fe(CN)6] + 2H2O Hàm lượng β-glucan có trong men bánh mì:
Gm = 0,98 × (V0/4V1) × 100%.
Hàm lượng β-glucan có trong sản phẩm β-glucan luận văn: GGL = 0,98 × (V0/V2) × 100%.
Hàm lượng β-glucan có trong mẫu sản phẩm sulfate β-glucan: GSG = 0,98 × (V0/V3) × 100%.
2.2.6. Xác định hiệu suất sulfate hóa 𝛃-glucan từ men bánh mì
Hiệu suất sulfate hóa được tính theo 2 cách: a. Hiệu suất tính theo khối lượng:
H1% = mBG(SG)
mBG(men) x 100% = GSGxMSG
GmxMm x 100%
Với: mBG(SG) là khối lượng β-glucan có trong sản phẩm sulfate β-glucan thu được từ 1 kg men bánh mì.
mBG(men) là khối lượng β-glucan có trong 1 kg nguyên liệu men bánh mì MSG và GSG: khối lượng β-glucan trong sản phẩm sulfate β-glucan thu được
Mm và Gm: khối lượng β-glucan có trong men bánh mì ban đầu.
Trong đó hàm lượng β-glucan trong men bánh mì và trong sản phẩm sulfate β-glucan được xác định bằng phương pháp của Barry (AOAC, 2016).
Gọi y, x lần lượt là số mol –SO3Na và số mol glucose có trong 1 gam sản phẩm sulfate β-glucan.
Hiệu suất sulfate hóa theo số mol xác định như sau: H2% = y/x
Trong đó: y tính từ phản ứng chuẩn độ sulfate bằng CPC, biết y có thể tính theo x từ phương trình: 180x + 103y – 18x – y = 1 hay 162x – 102y = 1. 2.3. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC SẢN PHẨM
2.3.1. Xác định β-glucan
Căn cứ cơ sở dữ liệu phổ HSQC từ công bố trên Data in Brief [76] (hình 2.1). Các tín hiệu của (1→3)β-glucan được thể hiện trên phổ là các tín hiệu của gốc glucose B1 và B2, được đánh dấu bằng các vòng tròn.
Đây là các tín hiệu tương ứng cả HNMR, CNMR và tương tác CH, vì vậy, khi đo phổ HSQC cua sản phẩm, nếu có chứa các tín hiệu này chúng tỏ có (1→3)β-glucan.
Sản phẩm sau khi tách chiết từ men bánh mì sẽ được ghi phổ HSQC, nếu phổ thu được của sản phẩm có các tín hiệu cộng hưởng tương ứng cả về phổ HNMR và CNMR đồng thời các tương tác C-H tương ứng trong phổ HSQC với phổ mẫu của đoạn mạch B1, B2 thì sản phẩm là (1→3)β-glucan.
2.2.2. Xác định cấu trúc sulfate β-glucan:
a. Dựa vào phổ IR
Theo công bố trên tạp chí Agricultural and Food Chemistry năm 2006, trong đó có phổ của sulfate β-glucan được điều chế từ yến mạch [50]. Phổ IR của sản phẩm sulfate hóa từ glucan tín hiệu dao động tại 1248 cm-1 và 810 cm- 1 chứng tỏ glucan đã được sulfate hóa. Đây cũng là công bố của tác giả Gabrielle C. Calegari, trên tạp chí Pharmacy and Pharmacology số 5 năm 2017 [77].
Hình 2.4. Phổ FT-IR của sulfate β-glucan [77].
Một công bố khác, 1111 và 804 cm-1, cũng là tín hiệu chứng tỏ có sulfate glucan đó là của tác giả M. Wang và các cộng sự được đăng trên tạp chí Biological Macromolecules 70 năm 2014 [78].
Hình 2.5. Phổ FT-IR của sulfate β-glucan [78]. b. Dựa vào phổ NMR
Tác giả Zhongwei Sun và các cộng sự trên công bố trên tạp chí Carbohydrate Polymers 77 năm 2009 [79], khẳng định phổ CNMR của sulfate β-glucan so với β-glucan sẽ xuất hiện thêm các peak mới về phía trường thấp (downfield) C4 (69,5 ppm) dịch chuyển đến C4-S (75,7 ppm), C2 (73,6 ppm dịch chuyển đến 79,8 ppm), do đã xảy ra sulfate hóa thế nhóm SO4 vào vị trí nhóm OH.
Hình 2.6. Phổ CNMR sản phẩm sulfate hóa S-RVS3-II, glucan RVS3-II [79] Đây là căn cứ có thể dựa vào để khẳng định β-glucan đã được sulfate
tương tác C-H thể hiện trên phổ HSQC, carbon không có liên kết với hydro nào, trong cấu trúc sulfate β-glucan không có dạng carbon này, hoặc đó chỉ là tín hiệu nhiễu.
Do đó, cần thiết phải kiểm tra trên phổ HSQC, nếu trên phổ HSQC của sản phẩm có thể hiện sự thay đổi do chuyển dịch về phía trường thấp tương ứng về cả CNMR và HNMR thì β-glucan đã được sulfate hóa. Trong đó, tại vị trí carbon nào có tín hiệu dịch chuyển về phía trường thấp thì tại vị trí đó, nhóm hydroxyl đã được thay thế bằng nhóm sulfate.
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT β-LUCAN VÀ TỔNG HỢP SULFATE β-GLUCAN TỪ MEN BÁNH MÌ. GLUCAN TỪ MEN BÁNH MÌ.
Sau khi tiến hành nhiều lần thí nghiệm tôi chọn nhiệt độ 80oC và thời gian khuấy 2 giờ thuận tiện cho việc sản xuất quy mô công nghiệp. Ở nhiệt độ trên nước không bị bay hơi tăng thời gian sử dụng của motor khuấy, hạn chế hư hỏng.
Tỉ lệ men bánh mì (β-glucan) : Na2S2O7, dựa trên phản ứng: R-OH + Na2S2O7 → ROSO3H + Na2SO4
Khối lượng phân tử của 1 đơn vị glucose trong mạch glucan là 180 – 18 = 162 (mỗi gốc liên kết đường mất đi 1 hydro và một nhóm hydroxyl), của Na2S2O7 là 222, 1 phân tử đường thế một gốc sulfate khối lượng tương ứng là 162:222, nếu thế được 2 gốc sẽ là 162:444, đồng thời trong quá trình sulfate hóa Na2S2O7 tan ra dần theo lượng nước được sinh ra từ phản ứng chứ không tan hết một lần, dựa theo tính toán và thực tế thí nghiệm khi quan sát lượng Na2S2O7 không tan hết, tỉ lệ men bánh mì (β-glucan) : Na2S2O7 được chọn là 1:3.
Tỉ lệ men bánh mì (β-glucan) : DMSO:
Tỉ lệ β-glucan : DMSO được chọn là 1 : 10, như sơ đồ đã thỏa mãn điều kiện phản ứng hết men bánh mì (β-glucan) trong quá trình phản ứng như kết quả trong báo cáo tổng hợp của TS. Nguyễn Duy Nhứt [1] vì vậy, không cần thiết phải tăng thêm DMSO vì đây là dung môi đắt tiền, giảm DMSO hỗn hợp đặc sệt lại, khó khăn cho khuấy trộn và phản ứng diễn ra.
Đối với quy trình tách chiết β-glucan tôi thực hiện theo “Quy trình điều chế β-glucan từ men bánh mì bằng chất lỏng ion” đã được TS. Nguyễn Duy Nhứt đăng trên công báo sở hữu công nghiệp số 368A, tháng 11/2018. Thực hiện quy trình này song song với phương pháp sulfate hóa trực tiếp để đối chứng hàm lượng β-glucan có trong men bánh mì với sản phẩm thu được, tính
3.1.1. Xác định β-glucan từ nấm men, β-glucan luận văn, sulfate β-glucan. glucan.
Để xác định hàm lượng β-glucan trong các sản phẩm luận văn, tôi tiến hành chuẩn độ 5 mL dung dịch K3Fe(CN)6 1% đến điểm tương đương, tiêu tốn hết V0, V1, V2, V3 mL dung dịch β-glucan chuẩn, men bánh mì và sulfate β- glucan, các số liệu thu thập được ghi trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng β-glucan các mẫu kiểm STT Mẫu thử Thể tích (mL) dịch đường khử tiêu tốn
cho chuẩn độ 5 mL K3Fe(CN)6 1%
Hàm lượng β-glucan 1 β-glucan chuẩn 14,80 14,60 14,60 Trung bình V0 = 14,67 ± 0,12 98,00% 2 β-glucan từ men bánh mì 25,20 25,40 25,40 Trung bình V1 = 25,33 ± 0,12 14,19% 3 β-glucan luận văn 15,00 14,80 14,80 Trung bình V2 = 14,87 ± 0,12 96,68%