2.
3.1.2 Zƒe" 8鵜nh ho衣t tính, ho衣t tính riêng và các y院u t嘘 違pj" j逢荏ng lê n-
galactosidase t詠 do
Ho衣t tính c栄c" -icncevqukfcug" 8逢嬰e" zƒe" 8鵜nh d詠c"vt‒p"rj逢挨pi"rjƒr"uq"o w"荏 d逢噂c sóng 420 nm b茨ng cách s穎 d映ng o-nitrophenyl- -D-icncevqr{tcpqukfg" *QPRI+" n " e挨" ch医t0"Rj逢挨pi"rjƒr" p {" 8逢嬰e"8隠 xu医t b荏i Cavaille và Combes (1995).
V噂i s詠 hi羽n di羽n c栄c" -galactosidase, ONPG b鵜 th栄y phân thành D-galactose (không màu) và o-pkvtqrjgpqn" QPR" *o w" x pi+." ejq" rjfir" 8鵜pj" n逢嬰ng m瓜t cách nhanh chóng ho衣t tính c栄c" -galactosidase.
a. Ho衣t tính -galactosidase
A挨p" x鵜 ho衣v"v pj"gp¦{og"*W+"n "n逢嬰ng enzyme có kh違 p<pi"z¿e"vƒe"n o"ejw{吋n hóa 3"oketqoqng"*3oqn+"e挨"ej医t sau m瓜t phút 荏 8k隠u ki羽n tiêu chu育n.
W"?"3oqn"e挨"ej医t (10-6 mol)/ phút.
Hình 2.2 Th栄{" rj¤p" e挨"ej医t ONPG Cách ti院n hành:
Cho vào 嘘ng nghi羽m 3,6 ml dung d鵜ej" 8羽m sodium phosphate 0.02 mol/l, pH 7.5, 100 µl gp¦{og" *gp¦{og" 8逢嬰c pha loãng 10 l亥n) và 300 µl ONPG 10 mM 8逢嬰c ph嘘i tr瓜n c育n th壱p0"A瓜 h医r"vjw"8逢嬰e"8q"v衣k"d逢噂c sóng 420 nm sau 1 phút v噂k"oƒ{"8q"swcpi" ph鰻. Ho衣v"v pj"8逢嬰c phát hi羽n d詠a trên công th泳c (2.1) (Pharmacia, Sweden) [12].
32 Ta có công th泳c tính ho衣t tính enzyme: U/ml = 岫代填鉄轍托貸代填鉄轍鐸托岻 諾迭辰唐 担 致 諾鉄 """"(Công th泳c 2.1) Vtqpi" 8„< 8怠: T鰻ng th吋 tích thí nghi羽m df: H羽 s嘘 pha loãng enzyme t: Th運i gian ph違n 泳ng
V2: Th吋 tích enzyme s穎 d映ng
: H羽 s嘘 b逸t màu c栄a O- nitrophenol 荏 420 nm (綱替態待噺 ね は岻. b. Ho衣v"v pj"tk‒pi" -galactosidase
Ho衣t tính riêng c栄a m瓜t ch院 ph育m enzyme là s嘘 8挨p"x鵜 enzyme/mg protein (U/mg protein) có trong 1 gram ch院 ph育m ho員c 1 ml dung d鵜ch enzyme.
U/mg protein= 砺 悼嶋"刀投当燈悼刀 悼塔"東梼搭盗刀套投 悼嶋"刀投当燈悼刀" c. Zƒe"8鵜nh pH t嘘k"逢w"*rJ0tp)
Kh違o sát ho衣t tính -galactosidase v噂k" e挨" ej医t ONPG 10 mM trong kho違ng pH t瑛 5.5- 8.0 (5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8.0) v噂i th運i gian xúc tác ph違n 泳ng 1 phút, 荏 50 0C. Trong 8„."rJ"e栄a môi vt逢運ng ph違n 泳pi"8逢嬰e"8k隠u ch雨nh b茨ng dung d鵜ej"8羽m phosphate. d. Zƒe"8鵜nh nhi羽v"8瓜 t嘘k"逢w"*V0tp)
Kh違o sát ho衣t tính -galactosidase v噂i nhi羽v"8瓜 nghiên c泳u trong kho違ng 30- 60 0C (30, 40; 45; 50; 55; 600C). Th運i gian xúc tác ph違n 泳ng là 1 phút v噂i pH0tp zƒe"8鵜nh 荏 vt‒p."e挨"ej医t là ONPG 10 mM.
33
2.3.2 C嘘 8鵜nh 糎-galactosidase vào ch医t mang TSI-gel
A吋 c嘘 8鵜nh -galactosidase vào TSI-gel, t瑛 v壱t li羽w" dcp" 8亥u là agarose, chúng tôi ti院n hành nhi隠u ph違n 泳ng hóa h丑e"8吋 t衣o ra ch医t mang TSI-gel v噂i các g嘘c ph違n 泳ng là fkuwnhkfg" qzkfg0" Ucw" mjk" 8«" e„" VUK-gel, chúng tôi b逸v" 8亥u ti院n hành c嘘 8鵜nh - galactosidase trên hai ch医t mang là agarose và TSI- gel nh茨o" e„" e挨" u荏 8ƒpj" ikƒ"jk羽u su医t c嘘8鵜nh và hi羽u qu違 th栄y phân.
Cách ti院n hành:
‚ M磯w"8嘘i ch泳ng: -galactosidase t詠 do
‚ M磯u c嘘 8鵜nh: -galactosidase c嘘 8鵜nh b茨ng agarose; -galactosidase c嘘 8鵜nh b茨ng TSI-gel.
‚ Ak隠u ki羽n c嘘8鵜nh: Nhi羽v"8瓜 = T0tp, pH= pH0tp c栄c" -galactosidase t詠 do. Rj逢挨pi"rjƒr"e嘘 8鵜nh: Hòa tan agarose và TSI-gel v噂i n欝pi"8瓜 thích h嬰p trong dung d鵜ej"8羽m phosphate pH 7.5 b茨ng cách nâng nhi羽v"8瓜 lên trên 50 0E0"Ucw"8„"n o"piw瓜i d鵜ch t噂i nhi羽v" 8瓜 t嘘k" 逢w" e栄a enzyme t詠 do (nhi羽v" 8瓜 gel còn l臼ng). B鰻 sung 1.0 ml enzyme vào 9.0 ml d鵜ch agarose và TSI-gel (t鰻ng th吋 tích h羽 ign"vjw"8逢嬰c là 10 ml), tr瓜p" 8隠u x " pjcpj" ej„pi" 8鰻 vào khuôn. Sau khi h羽 ign"8«"8逢嬰e"8»pi"e泳ng 荏 nhi羽v"8瓜 phòng, c逸t gel thành nh英ng kh嘘k" j·pj" xw»pi" e„" m ej" vj逢噂c 5x5 mm và r穎a nhi隠u l亥n v噂k" p逢噂c c医v" 8吋 lo衣i b臼 nh英ng enzyme còn sót l衣i trên b隠 m員t h衣t gel. Nh英ng h衣t gel v瑛c" 8逢嬰c t衣o thành s胤 ti院p t映e"8逢嬰e"n逢w"荏 4 0C trong trong dung d鵜ej"8羽m phosphate pH 7.5.
A吋 zƒe"8鵜nh 8逢嬰c n欝pi"8瓜 ch医t mang phù h嬰p cho quá trình c嘘 8鵜nh, chúng tôi ti院n hành kh違o sát các n欝ng 8瓜 agarose t瑛 0.5- 2.0% và n欝pi"8瓜 TSI-gel t瑛 0.5- 3.0% . D詠a vào hi羽u su医t c嘘 8鵜nh, chúng tôi l詠a ch丑p" 8逢嬰c n欝pi" 8瓜 agarose và TSI-gel phù h嬰p
dùng cho c嘘8鵜nh enzyme.
34 HEA = 凋轍貸凋 凋轍 . 100% Vtqpi" 8„< HEA: hi羽u su医t c嘘8鵜nh enzyme (%) A0<"n逢嬰pi"gp¦{og" dcp"8亥w"fwpi" 8吋 c嘘8鵜nh (g)
C<" n逢嬰ng enzyme b鵜 thoát ra ngoài ch医t mang trong quá trình c嘘 8鵜pj"*i+"jc{"n逢嬰ng enzyme có trong dung d鵜ch sau c嘘8鵜nh.
2.3.3 Nghiên c泳u tính ch医t c栄a ch院 ph育m 糎-galactosidase c嘘8鵜nh
Ucw"mjk"zƒe"8鵜pj"8逢嬰c n欝pi"8瓜 TSI-ign"vj ej"j嬰r"8吋"e嘘"8鵜pj" -galactosidase, chúng tôi ti院n hành nghiên c泳u các y院u t嘘 違pj"j逢荏ng lên tính ch医t c栄a ch院 ph育m c嘘 8鵜pj"pj逢" pH và nhi羽v"8瓜.
2.3.3.1 Zƒe"8鵜nh giá tr鵜 pH t嘘k"逢w
A吋 zƒe" 8鵜nh giá tr鵜 pH t嘘k"逢w."ej¿pi"v»k"vk院n hành kh違o sát ho衣t tính enzyme 荏 các giá tr鵜 pH khác nhau v噂k"e挨"ej医t là ONPG 10 mM, nhi羽v"8瓜 ph違n 泳ng là 50 0C. T瑛 8„" zƒe"8鵜pj"8逢嬰c giá tr鵜 pH t嘘k"逢w0
‚ Thông s嘘rJ""vjc{"8鰻i: 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0
‚ E挨"ej医t ONPG 10 mM
‚ Thông s嘘 c嘘8鵜nh: nhi羽v"8瓜 50 0C, t益 l羽 enzyme: ch医t mang = 1: 9 (v/v)
2.3.3.2 Zƒe"8鵜nh giá tr鵜 nhi羽v"8瓜 t嘘k"逢w
A吋 zƒe"8鵜nh giá tr鵜 nhi羽v"8瓜 t嘘k"逢w."ej¿pi"v»k"vk院n hành kh違o sát ho衣t tính enzyme 荏 các giá tr鵜 nhi羽v"8瓜 khác nhau v噂k"e挨"ej医t là ONPG 10 mM, giá tr鵜 pH là pHotp. T瑛 8„" zƒe"8鵜pj"8逢嬰c giá tr鵜 nhi羽v"8瓜 t嘘k"逢w0
‚ Thông s嘘 nhi羽v"8瓜 vjc{" 8鰻i: 30, 40; 45; 50; 55; 60 0C
‚ E挨"ej医t ONPG 10 mM
35
2.3.3.3 Zƒe"8鵜nh kh違 p<pi"d隠n nhi羽t
A吋 8ƒpj" ikƒ" mj違 p<pi" d隠n nhi羽t c栄a enzyme c嘘 8鵜nh, chúng tôi ti院n hành ph違n 泳ng th栄y phân ONPG v噂i enzyme t詠 do và enzyme c嘘 8鵜nh khi 8逢嬰c 栄 v噂i nhi羽v"8瓜 50 0C. Th運i gian 栄 là 8 gi運 (h) cho enzyme t詠 do và enzyme c嘘 8鵜nh. M磯w"8逢嬰c l医y ra c泳 sau 2 gi運 (h). Ho衣v"v pj"8逢嬰e"zƒe"8鵜nh b茨pi" rj逢挨pi" rjƒr" uq"o w"swcpi" rj鰻.
‚ Th運k" ikcp"vjc{"8鰻i: 0, 2, 4, 6, 8 gi運
‚ E挨"ej医t ONPG 10 mM
‚ Nhi羽v"8瓜 ph違n 泳ng: 50 0C ‚ pH ph違n 泳ng: pHotp
2.3.4 Nghiên c泳w"8瓜ng h丑c c栄a 糎-galactosidase
M映e" 8 ej" ej pj" e栄a vi羽e" zƒe" 8鵜nh các thông s嘘 8瓜ng h丑c cho enzyme c嘘 8鵜nh là thi院t l壱p s詠 違pj"j逢荏ng lên quá trình chuy吋p"j„c"x "v逢挨pi"vƒe"e栄c"e挨"ej医t lên v鵜 trí xúc tác b荏k" rj逢挨pi" rjƒr" e嘘 8鵜nh và các thông s嘘 mjƒe0" E pi" pj逢" eƒe" rj違n 泳pi"8瓜ng l詠c hóa h丑c, t嘘e" 8瓜 ph違n 泳pi" dcp" 8亥w" 8逢嬰e" zƒe" 8鵜nh b荏k" e挨" ej医v" 8員c tt逢pi" ejq" o厩i enzyme.
Cách ti院n hành:
A吋 zƒe" 8鵜nh 違pj"j逢荏ng c栄a các liên k院t enzyme và ch医t mang lên quá trình xúc tác t衣o s違n ph育m, các giá tr鵜 c栄a h茨ng s嘘 8瓜ng h丑c Km và Vmax 8逢嬰e"zƒe"8鵜nh b茨ng cách th栄y phân ONPG.
Fq" 8„." gp¦{og" e嘘 8鵜nh và enzyme t詠 fq" 8逢嬰e" 8go" rj違n 泳ng v噂i các n欝pi" 8瓜 ONPG khác nhau 荏 8k隠u ki羽n nhi羽v"8瓜 và pH t嘘k"逢w. N欝pi"8瓜 QPRI"8逢嬰e"vjc{"8鰻i t瑛 2.0- 30.0 oO" 8嘘i v噂i enzyme t詠 do và enzyme c嘘 8鵜nh b荏i agarose và TSI-gel. B茨ng eƒej" zƒe" 8鵜nh giá tr鵜 ONP sinh ra trong quá trình ph違n 泳ng và d詠a vào s詠 ph映 thu瓜c n欝pi" 8瓜 bão hòa c栄a các ch医t, chúng tôi xây d詠pi" 8逢嬰e" 8逢運ng cong Michaelis- Menten. T瑛 8„." eƒe" ikƒ" vt鵜 Mo" x " Xocz" 8逢嬰e" zƒe" 8鵜nh b茨ng cách s穎 d映ni" rj逢挨pi" trình Lineweaver-Burk.
36 Rj逢挨pi" vt·pj"8瓜ng h丑c Michaelis Î Menten có d衣ng:
8 噺 8鱈叩淡岷5峅 -鱈髪 岷5峅 Vtqpi" 8„<"Mm8逢嬰c g丑i là h茨ng s嘘 Michaelis. V: là v壱n t嘘c ph違n 泳ng. Vmax: là v壱n t嘘c c詠e"8衣i. [S]: là n欝pi"8瓜e挨"ej医t.
Hình 2.3 S詠 ph映 thu瓜c c栄a t嘘e"8瓜 ph違n 泳ng vào n欝pi"8瓜e挨"ej医t theo Lineweaver-Burk [6]
A吋 bi吋u di宇p" rj逢挨pi"vt·pj"p {"e亥n ti院n hành nhi隠u thí nghi羽o"8吋 8衣t s詠 chính xác, p‒p"Nkpgcygcxgt" x " Dwtm"8«"e違i ti院p"rj逢挨pi" vt·pj"p {" pj逢"ucw<
Rj逢挨pi" vt·pj"Nkpgygcxgt-Burk [6]. な 8 噺 -鱈 8鱈叩淡 な 岷5峅 髪 な 8鱈叩淡
37 Rj逢挨pi" vt·pj" e„" f衣pi"8逢運ng th鰯ng, c逸t tr映c hoành t衣k"8k吋m 貸怠
啄悼 và c逸t tr映c tung t衣i
8k吋m 怠
諾悼倒灯.
""pij c"e栄a h茨ng s嘘8瓜ng h丑c Km và Vmax:
Vì Km 8員e"vt逢pi"ejq"ƒk"n詠c c栄a enzyme v噂k"e挨"ej医t, fq"8„ Km có tr鵜 s嘘 càng nh臼 thì ái l詠c c栄a enzyme v噂k"e挨"ej医t càng l噂p."pij c"n "x壱n t嘘c c栄a ph違n 泳ng do enzyme xúc tác càng l噂n.
2.3.5 Kh違o sát s嘘 l亥n tái s穎 d映ng và nhi羽v"8瓜 b違o qu違n c栄a ch院 ph育m enzyme c嘘8鵜nh 8鵜nh
2.3.5.1 Kh違o sát s嘘 l亥n tái s穎 d映ng
Vi羽c tái s穎 d映ng enzyme là m瓜t trong nh英ng m映c tiêu chính c栄a c嘘 8鵜nh enzyme. A員c bi羽t, t壱n d映ng hi羽u qu違 chi phí s穎 d映ng enzyog" mjk" eƒe" gp¦{og" p {" 8逢嬰c dùng trong các h羽 th嘘ng s違n xu医t liên t映e0"姶w"8k吋m chính c栄a vi羽c c嘘8鵜nh enzyme là có th吋 s穎 d映ng l衣i enzyme b茨ng cách tách chúng ra kh臼i h厩n h嬰p ph違n 泳ng d宇 f pi0" Fq"8„." ejk"rj "8逢嬰c gi違o"8員c bi羽t là quá trình liên t映c.
Cách ti院n hành:
Chúng tôi s穎 d映pi" QPRI" 32" oO" n o" e挨" ej医v" 8吋 kh違o sát s嘘 l亥n tái s穎 d映ng c栄a enzyme c嘘 8鵜nh. K院t thúc m厩i l亥n ph違n 泳ng, các enzyme c嘘 8鵜pj"8逢嬰c thu h欝i và r穎a s衣ch b茨ng dung d鵜ej"8羽m. Th運i gian ph違n 泳ng là 10 phút 荏 50 0C.
2.3.5.2 Kh違o sát nhi羽v"8瓜 b違o qu違n
Quá trình b違o qu違n ch院 ph育m -galactosidase c嘘 8鵜nh 8„pi" xck" vt”" t医t quan tr丑ng. Fq"8„."8吋 8ƒpj"ikƒ"u詠 鰻p"8鵜nh trong quá trình b違o qu違n, chúng tôi kh違o sát 荏 hai nhi羽t 8瓜 khác nhau là 4 0C và 25 0E0" -galactosidase c嘘 8鵜nh b荏i TSI-gel s胤 8逢嬰c b違o qu違n trong dung d鵜ej"8羽m phosphate pH 7.5.
38 Ho衣v" v pj" gp¦{og" 8逢嬰e" zƒe" 8鵜nh b茨ng cách s穎 d映pi" QPRI"n "e挨"ej医t sau nhi隠u ngày b違o qu違n khác nhau: 5, 10, 15, 20 ngày.
2.3.6 Thi院t k院 k悦 thu壱t lên men liên t映c s違n ph育m s英a nghèo lactose
Qui trình công ngh羽 8逢嬰c thi院t k院 d詠a trên s詠 k院t h嬰p gi英a các quá trình lên men t衣o s違n ph育m s英a nghèo lactose b茨ng ch院 ph育m enzyme c嘘 8鵜nh. Vtqpi" 8„." suá trình n‒p" ogp" 8逢嬰c th詠c hi羽n liên t映c v噂i s詠 th栄y phân 8逢運ng lactose có trong s英c" v逢挨k" nguyên li羽u b荏i -galactosidase c嘘8鵜nh.
- galactosidase c嘘 8鵜nh có th吋 8逢嬰e"8逢c"vt詠c ti院p vào s英c"8吋 n‒p"ogp."pj逢pi"u胤 逢w" vi羽v"j挨p"mjk"ej¿pi"8逢嬰c ch泳a 荏 các thi院t b鵜 ph違n 泳ng và s英a s胤 8k"swc"eƒe"thi院t b鵜 này vt逢噂c ho員c sau quá trình lên men 荏 m瓜t giá tr鵜rJ"mj»pi"8鰻i.
Fq" 8„." rj逢挨pi" ƒp" e栄a thi院t k院 k悦 thu壱t là thi院t k院 qui trình s違n xu医t s英a nghèo lactose mà quá trình lên men liên t映c qua m瓜t ho員c nhi隠u thi院t b鵜 ph違n 泳ng ch泳a -
galactosidase c嘘8鵜nh.
Bài toán thi院t k院:
‚ A隠 xu医t thi院t b鵜 ph違n 泳ng th栄y phân lactose: Backed bed reactor (PBR). ‚ Thi院t k院 qui trình lên men liên t映c t衣o s違n ph育m s英a nghèo lactose v噂i thi院t
b鵜 PBR.
2.4 Rj逢挨pi"rjƒr" rj¤p" v ej
2.4.1 Rj逢挨pi"rj逢挨pi" rjƒr" Nqyt{"zƒe"8鵜pj"j o"n逢嬰ng protein- enzyme
Nguyên t逸c:
Có th吋 v pj" j o" n逢嬰ng protein c栄a m磯u nghiên c泳u d詠a x q" 8逢運ng chu育n c栄a protein và d詠a vào ph違n 泳ng màu c栄a protein v噂i thu嘘c th穎 Hqnkp0"E逢運pi"8瓜 màu c栄a dung d鵜ch t益 l羽 thu壱n v噂i n欝pi"8瓜 protein.
Hóa ch医t
39 - Rtqvgkp"8逢嬰c hòa tan trong dung d鵜ch NaCl 0.9% v噂k"n逢嬰ng protein trong 1 ml có 10, 42." 52." 62." :2" i" rtqvgkp0" Fwpi" f鵜ch chu育p"vj逢運ng dùng tinh th吋 albumin huy院t thanh
bò (BSA Î bovine serum albumin).
- Dung d鵜ch A: Dung d鵜ch Na2CO3 2 % trong NaOH 0.1N. - Dung d鵜ch B1 và B2.
- B1: dung d鵜ch CuSO4 1 %.
- B2: dung d鵜ch mu嘘i Segnette 2 % (K Na tartrat).
- Dung d鵜ch C: h厩n h嬰p 0,5 ml dung d鵜ch B1, 0,5 ml dung d鵜ch B2 và 50 ml dung d鵜ch A (dung d鵜ch C chu育n b鵜 vt逢噂c khi dùng 30 phút).
- Dung d鵜ch D: dung d鵜ch Folin n欝pi"8瓜 1N.
Ti院n hành
D詠pi"8逢運ng chu育n protein
L医y 1ml dung d鵜ch protein chu育n theo các n欝pi" 8瓜 8«" dk院v" vt逢噂c cho vào 嘘ng nghi羽m, cho thêm 5 ml dung d鵜ch C. L逸e"8隠w."8吋 荏 nhi羽v"8瓜 trong 10 phút. Ti院p t映c cho thêm 0,5ml dung d鵜ch D, l逸c, 8吋 30 phút và 8q"vt‒p"oƒ{"uq"o w"荏 d逢噂c sóng 750 nm. A欝ng th運i làm 嘘ng ki吋m tra v噂i hóa ch医v"pj逢"嘘ng nghi羽m chu育p"pj逢pi"vjc{"fwpi"f鵜ch protein b茨pi" p逢噂c. D詠a vào m壱v"8瓜 quang, xây d詠pi" 8逢運ng chu育n protein
Zƒe"8鵜pj"j o"n逢嬰ng protein-enzyme
L医y 1ml dung d鵜ch protein nghiên c泳u cho vào 嘘ng nghi羽m, cho thêm 5 ml dung d鵜ch C. L逸e" 8隠w." 8吋 荏 nhi羽v"8瓜 trong 10 phút. Ti院p t映c cho thêm 0,5 ml dung d鵜ch D, l逸c, 8吋 30 phút và 8q"vt‒p"oƒ{"uq"o w"荏 d逢噂c sóng 750 po0"A欝ng th運i làm 嘘ng ki吋m tra v噂i hóa ch医v"pj逢"嘘ng nghi羽m chu育p"pj逢pi"vjc{"fwpi"f鵜ch protein b茨pi"p逢噂c. N欝ng 8瓜 protein nghiên c泳w"8逢嬰e"v pj"vjgq"n逢嬰ng protein 荏 8欝 th鵜 chu育n.
40
2.4.2 Rj逢挨pi"rjƒr" zƒe"8鵜pj"n逢嬰pi"8逢運ng kh穎 theo Miller
Nguyên t逸c
Rj逢挨pi" rjƒr" p {" f詠c" vt‒p" e挨" u荏 ph違n 泳ng t衣o màu gi英c" 8逢運ng kh穎 v噂i thu嘘c th穎 3,5- fkpkvtqucnku{nke" *FPU+0"E逢運pi"8瓜 màu c栄a h厩n h嬰p ph違n 泳ng t益 l羽 thu壱n v噂i n欝ng 8瓜8逢運ng kh穎.
D詠c" vjgq"8欝 th鵜 chu育n c栄a glucose tinh khi院t v噂i thu嘘c th穎 acid dinitrosalisylic s胤 v pj"8逢嬰e"j o"n逢嬰pi"8逢運ng kh穎 c栄a m磯u nghiên c泳u.
Hoá ch医t
Thu嘘c th穎 acid dinitrosalisylic (DNS): cân 1g DNS pha trong 20 ml dung d鵜ch NaOH 2N, thêm vào 50 on"p逢噂c c医t và 30 g mu嘘k"uqfkwo"rqvcuukwo"vctvtcvg0"Awp"pj姻 cho tan r欝k"8鵜nh m泳c t噂i 100 ml.
Dung d鵜ch glucose m磯u (1mg/ml): cân chính xác 100 mg D-glucose, hòa tan trong 100
ml n逢噂c c医t.
Cách ti院n hành
D詠pi"8逢運ng chu育n glucose
T瑛 dung d鵜ch glucose chu育n, pha các dung d鵜ch glucose chu育n có n欝pi"8瓜 t瑛 0 Î 1000 (mg/ml).
V胤 8逢運ng chu育n glucose v噂i tr映c tung là m壱v"8瓜 quang, tr映c hoành là n欝pi"8瓜 glucose.
Ti院n hành thí nghi羽m:
Ph違n 泳ng c栄a dung d鵜ej" 8逢運ng c亥n phân tích v噂i thu嘘c th穎 FPU"8逢嬰c ti院p"j pj"pj逢" trong ph亥n xây d詠pi" 8欝 th鵜 chu育n. N欝pi" 8瓜 8逢運ng kh穎 trong m磯w"8逢嬰e"zƒe"8鵜nh nh運 x q"8逢運ng chu育p" inwequg"8ã d詠ng.
2.4.3 Rj逢挨pi"rjƒr" zƒe"8鵜nh ho衣t tính enzyme c嘘8鵜nh
Chúng tôi s穎 d映pi" 8逢運ng chu育n n欝pi" 8瓜 ONP theo m壱v" 8瓜 quang làm e挨" u荏 xác 8鵜nh n欝pi"8瓜 ONP mM sinh ra khi enzyme th栄y phân ONPG.
41 J·pj"406"A逢運ng chu育n n欝pi"8瓜 ONP (mM) [12]
Cách ti院n hành:
Cân 1 g ch院 ph育m -galactosidase c嘘 8鵜nh cho vào 嘘ng nghi羽m. Cho thêm vào 嘘ng nghi羽m 2.80 ml sodium phosphate 0.02 mol/l, pH 7.5 l逸e"8隠w"vtqpi"42"rj¿v0"Ucw"8„"ejq" vào 0.2 ml ONPG 10 mM, ph違n 泳pi"vtqpi"32"rj¿v0"Ago"8q"o壱v"8瓜 quang 荏 d逢噂c sóng 420 nm [12].
M瓜v" 8挨p"x鵜 enzyme c嘘 8鵜pj"W"8逢嬰c bi吋u di宇p"pj逢"n逢嬰ng enzyme chuy吋p"j„c"8逢嬰c 1 µmol ONPG trong 1 phút (µmol ONP.ph-1.g-1).
Piq k"tc."8吋 so sánh ho衣t tính enzyme t詠 do và enzyme c嘘 8鵜nh. Chúng tôi s穎 d映ng 8挨p"x鵜 ho衣t tính riêng (U/ mg+"n o"e挨"u荏 8ƒpj"ikƒ0
2.4.4 Rj逢挨pi"rjƒr" v衣o thiolsulfinate- agarose
42
D逢噂c 1: T衣o pha r逸n thiol- agarose
Hòa 15g b瓜t agarose trong 15 ml NaOH 1M; Cho vào c育n th壱n 2.5 ml
epichlorhoydrin, khu医{"8隠u; 曳 swc"8‒o"荏 nhi羽v"8瓜 phòng (22- 25 0C ) l逸c liên t映c. Sau 8„." ehuy吋n qua m瓜t ph宇u l丑c th栄y tinh và r穎a s衣ch b茨pi" p逢噂c c医t, thao tác nhanh chóng.
D逢噂c ti院p theo cho vào h羽 gel 0.5 M dung d鵜ej"8羽m sodium phosphate, pH 6.5 và 8鵜nh m泳c lên 15 ml v噂i dung d鵜ej"8羽m trên. Ti院p t映c cho vào 15 ml sodium thiosulfate 2M và 栄 swc" 8‒o"荏 nhi羽v"8瓜 phòng (22- 250C ), l逸e"8隠u. Th運i gian t嘘i thi吋u là 6 gi運. Ucw" 8„" n衣i r穎a b茨pi" p逢噂c c医v0" N逢w" j羽 ign" vt‒p" vtqpi" p逢噂c c医t 荏 4 0E" 8院n khi c亥n s穎 d映ng.
D逢噂c quan tr丑pi" 8吋 hình thành thiol- agarose: l医y 15 g h羽 gel trên hòa vào 15 ml
dung d鵜ej" 8羽m sodium bicarbonate 0.2 M, pH 8.5; Hòa tan 3g DTT trong 15 ml
ethylene diamine tetraacetic 1mO"*GFVC+."ucw"8„"ejq"x q"j羽 gel trên; 曳 h鰻n h嬰p trên trong su嘘t 1 gi運 荏 nhi羽v"8瓜 phòng (22- 25 0C) có l逸e"8隠u.
Cu嘘i cùng, chuy吋n h厩n h嬰p trên vào ph宇u l丑c th栄y tinh và r穎a v噂i các dung d鵜ch sau theo th泳 t詠: dung d鵜ej" 8羽o" uqfkwo" dkectdqpcvg" 204" O." rJ" :07=" p逢噂c c医t; dung d鵜ch acetic acid 0.1 M 8吋 lo衣i b臼 DTT.
Nh英pi"d逢噂c th詠c hi羽n trên s胤 vjw"8逢嬰c d磯n xu医t thiol- agarose có ch泳a t瑛 400- 600 µmol nhóm liên k院t thiol trên 1 gram gel khô [11].
D逢噂c 2: Disulfide-agarose (S2-Gel)
Cho 15 gram thiol-agarose vào 30 ml dung d鵜ej"8羽m sodium phosphate 0.1M, pH