Nồng độ các chất IgA, IgG và IgM được định lượng thường gắn với các bệnh cụ thể để đánh giá đáp ứng cơ thể trước các tác nhân. Kết quả xét nghiệm nồng độ IgG, IgA và IgM thường được đánh giá cùng nhau. Khi có bất thường nồng độ, điều này gợi ý đã có yếu tố ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch. Xét nghiệm globulin miễn dịch thường không sử dụng để chẩn đoán mà để đánh giá tình trạng bệnh lý cũng như đáp ứng của cơ thể. Ở bệnh nhân HCTH, các globulin miễn dịch này đường được định lượng cùng nhau [76]. Trên lâm sàng thường có một số phương pháp định lượng nồng độ IgA, IgG và IgM.
- Phương pháp miễn dịch đo độ đục: Phương pháp miễn dịch đo độ đục
(turbidity immunoassay) dựa trên nguyên lý kháng nguyên kết hợp với kháng thể tạo thành PHMD kháng nguyên-kháng thể kết tủa làm thay đổi độ đục của dung dịch. Đo độ đục của dung dịch ở bước sóng xác định. Sự tăng độ hấp thụ quang tỷ lệ với nồng độ chất cần đo. Cho phép xác định lượng kháng thể kết tủa với một lượng kháng nguyên đã biết. Cho một lượng huyết thanh hoặc huyết tương vào dung dịch phản ứng để tạo phức hợp KN-KT và định lượng bằng phương pháp đo độ đục để xác định lượng kháng thể (kháng nguyên) đã phản ứng có trong mẫu thử. Phương pháp này đã được ứng dụng để định lượng các globuline miễn dịch.
- Phương pháp hoá phát quang miễn dịch: Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch
hóa phát quang (Chemiluminescent Immuno Assay: CLIA) dựa trên nguyên lý kháng nguyên (chất có trong mẫu bệnh phẩm) kết hợp với kháng thể (chất có trong thuốc thử) có gắn chất đánh dấu (thường là phân tử Acridinium Ester). Nhờ chất đánh dấu có khả năng phát quang khi thay đổi pH của dung dịch phản ứng và tín hiệu phát quang được khuếch đại qua một ống nhân quang mà người ta có thể định lượng các chất có nồng độ rất thấp hoặc các
chất bất thường trong cơ thể với độ chính xác rất cao so với các kỹ thuật hóa sinh thông thường khác. Phân tử Acridinium ester có trong lượng phân tử nhỏ hơn rất nhiều so với các enzyme trong phản ứng ELISA do đó tăng khả năng thâm nhập vào cơ chất và giảm thiểu hiệu ứng che lấp trung tâm hoạt động của KN và KT do đó độ chính xác tăng đáng kể so với phương pháp ELISA (đặc biệt khi định lượng những chất có nồng độ thấp).
- Phương pháp điện hoá phát quang: Kỹ thuật điện hóa phát quang (ECL:
Electrode Chemi Luminescence) sử dụng chất đánh dấu Ruthenium khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học, vì vậy có khả năng phát hiện chất có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh. Công nghệ ECLIA là kỹ thuật hiện đại sử dụng chất đánh dấu là Ruthenium(II)-tris(bipyrrydyl) [Ru(bys)32+] và Tripopylamine (TPA). Khi phức hợp kháng nguyên - kháng thể có gắn chất đánh dấu được gắn lên bề mặt điện cực thì quá trình khởi động điện bắt đầu. Dưới tác dụng của dòng điện có điện áp 2V, hợp chất phát ra photon ánh sáng và giải phóng electron quay trở lại bám trên bề mặt điện cực. Cường độ ánh sáng tỷ lệ với nồng độ chất cần phân tích và là cơ sở cho việc tính toán nồng độ chất cần đo. ECLIA đã khắc phục nhược điểm của hóa phát quang (Chemiluminescence) bằng cách sử dụng dòng điện để dễ dàng chuyển phân tử Ruthenium sang trạng thái kích thích do mất electron, ở trạng thái này phân tử Ruthenium phát quang. Do đó điện hóa phát quang có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn hóa phát quang. Đặc biệt với nguyên lý cạnh tranh khi sử dụng chất đánh dấu gắn lên chất cần đo (Kháng thể đơn dòng ) đã giúp cho kết quả xét nghiệm sử dụng công nghệ ECLIA có độ chính xác và tin cậy rất cao. Miễn dịch điện hóa phát quang sử dụng 3 loại nguyên lý như sau: Nguyên lý Sandwich, Nguyên lý cạnh tranh, Nguyên lý bắc cầu (thường áp dụng khi định lượng IgA, IgG và IgM…)
- Phương pháp ELISA: Nguyên lý của kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked
Immunosorbent assay) là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể và được thực hiện bằng những bước cơ bản sau: Kháng nguyên - antigen hoặc kháng thể - antibody đã biết được gắn trên một giá thể rắn, sau đó cho mẫu có chứa kháng thể - antibody hoặc kháng nguyên cần tìm vào giếng. Bổ sung thêm kháng thể có gắn với ezyme. Bước cuối cùng thêm cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu màu có thể xác định được bằng máy đo huỳnh quang. Phương pháp ELISA thường áp dụng trong nghiên cứu, bởi tiêu tốn nhiều thời gian thực hiện. Có 4 phương pháp ELISA như sau:
+ ELISA trực tiếp (direct ELISA): Phương pháp này thường sử dụng trong ELISA định tính, ít dùng trong định lượng. Phương pháp này có ưu điểm là chỉ cần một lần ủ do đó tiết kiệm thời gian và tối thiểu được việc kiểm soát các điều kiện trong quá trình thực hiện (thay đổi nhiệt độ và buffer cho mỗi lần ủ, tính thời gian…). Tuy nhiên, nhược điểm của nó là nhuộm màu nền (background staining) cao do sự liên kết không đặc hiệu của kháng thể với bề mặt rắn và các protein cố định trên bề mặt rắn. Việc đánh dấu từng loại kháng thể sử dụng cho mỗi kháng nguyên cũng khá tốn kém, nhất là khi phải chẩn đoán một số lượng lớn các loại kháng nguyên khác nhau.
+ ELISA gián tiếp (indirect ELISA): Ưu điểm của phương pháp này là độ nhạy cao chỉ cần tạo một loại kháng kháng thể mang enzyme để nhận biết cho nhiều kháng nguyên khác nhau. Tuy nhiên nhược điểm của nó là tăng số bước thực hiện do đó làm tăng việc kiểm soát các điều kiện, quá trình thực hiện xét nghiệm và kéo dài thời gian chẩn đoán.
+ ELISA sandwich: Phương pháp này có khá nhiều ưu điểm vượt trội, thứ nhất là độ nhạy cao giảm được nhuộm màu nền và các phản ứng không đặc hiệu do đã loại bỏ được hầu hết các thành phần tạp, phản ứng được thực hiện dễ dàng hơn.
+ ELISA cạnh tranh (competitive ELISA): ELISA cạnh tranh là phương pháp ELISA rất hiệu quả cho định lượng các yếu tố hiện diện trong mẫu với lượng nhỏ. ELISA cạnh tranh sử dụng một lượng kháng nguyên cùng loại với kháng nguyên mà ta muốn định lượng trong mẫu (kháng nguyên cạnh tranh) cho phản ứng miễn dịch với cùng một loại kháng thể đặc hiệu cố định trên mặt rắn, sau đó đo lượng kháng nguyên cạnh tranh này thông qua hoạt tính enzyme được liên kết với nó. Kháng nguyên cạnh tranh càng hiện diện nhiều cho biết loại kháng nguyên đó trong mẫu càng ít và ngược lại.