lọc đến sinh trưởng cây con cà phê vối trong điều kiện nhà lưới
Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đến khả năng sinh trưởng của cây con cà phê vối trong điều kiện nhà lưới.
* Thời gian và địa điểm thí nghiệm: thí được tiến hành trong nhà lưới tại Trại thực nghiệm Nơng Lâm Nghiệp, trường Đại học Tây Nguyên trong thời gian từ tháng 12/2015 đến tháng 6/2016.
* Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn: Các chủng vi khuẩn được nhân nuơi cấy trên mơi trường M1 ở điều kiện nhiệt độ phịng với tốc độ lắc 150 rpm trong thời gian nuơi cấy 48h. Mơi trường nuơi cấy vi khuẩn sau đĩ được ly tâm ở 4000 v/phút trong 20 phút để tách vi khuẩn ra khỏi mơi trường nuơi cấy. Sau ly tâm, thu phần dịch nổi bên trên và lọc qua 2 lớp giấy lọc Whatman số 1 (Mekete et al., 2009) [134]. Điều chỉnh để mật độ vi khuẩn đạt 109 CFU/mL. Kết quả thu được được coi là dịch huyền phù vi khuẩn tiêu chuẩn và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4◦C để sử dụng.
* Chuẩn bị bầu để ươm hạt cà phê:
Dùng túi nylon cĩ kích thước 17 x 25 cm, đục 8 lỗ đường kính 0,5 cm cách đáy bầu khoảng 2 - 4cm để dễ thốt nước. Đất dùng để vào bầu là lớp đất mặt từ 0 – 20 cm, tơi xốp và nhiều mùn. Dùng lớp đất mặt (đã được xử lý tiệt trùng) trộn lẫn với 25% xơ dừa sạch để tạo thành hỗn hợp đĩng bầu.
* Chuẩn bị hạt cà phê vối
Hạt cà phê vối lai giống TRS1 được khử trùng bằng KMnO4 5% trong 1 giờ, lắc qua cồn 70o trong 1 phút, đưa vào tủ vơ trùng để xử lý NaOCl 5% trong 40 phút và thêm 3 giọt Tween 80 rồi rửa sạch bằng nước cất vơ trùng. Cho hạt vào đĩa petri cĩ bơng đã được khử trùng, với một ít nước cất vơ trùng và ủ cho tới khi hạt nảy mầm, rửa sạch hạt bằng nước cất. Sau đĩ, cho hạt cà phê đã nảy mầm vào ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn (mật độ 109 CFU/mL) đã chuẩn bị trong 30 phút, rồi gieo 1 hạt vào từng bầu đất đã khử trùng. Chăm sĩc cho đến khi cây con được 2 cặp lá thật, tưới 10 ml (mật độ 109 CFU/mL) huyền phù vi khuẩn thí nghiệm vào từng bầu đất. Hai cơng thức đối chứng được sử dụng trong thí nghiệm là đối chứng ĐC0 (hạt khơng được ngâm huyền phù vi khuẩn cũng như mơi trường dinh dưỡng nhân nuơi sinh khối
vi khuẩn M1) và đối chứng ĐC (hạt được ngâm trong mơi trường M1). Chăm sĩc cho đến khi cây con được 2 cặp lá thật, tưới huyền phù vi khuẩn thí nghiệm vào từng bầu đất (10ml/bầu). Mỗi chủng vi khuẩn là 1 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức cĩ 30 cây. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, gồm 11 cơng thức, được lặp lại 3 lần.
- CT1: Bacillus cereus M15 - CT2: Bacillus subtilis EK17 - CT3: Enterobacter cloace EK19 - CT4: Bacillus sp. Cư8 - CT5: chủng vi khuẩn BH8 - CT6: Bacillus cereus BMT7 - CT7: Bacillus pumilus BMT4 - CT8: Bacillus sp. BMT8 - CT9: Bacillus sp. BMT11
- CT10: đối chứng ĐC (mơi trường M1) - CT11: đối chứng ĐC0 (nước lã)
*Các chỉ tiêu theo dõi: các chỉ tiêu sau được theo dõi sau khi chủng nhiễm vi khuẩn nội sinh vào cây con 2 và 4 tháng. Mỗi cơng thức, chọn 5 cây ngẫu nhiên để đo đếm các chỉ tiêu sau:
- Chiều cao cây (cm): đo từ mặt bầu cà phê đến đỉnh sinh trưởng của cây - Đường kính gốc thân (mm): Dùng thước kẹp Palmer để đo đường kính gốc cây ở vị trí cách mặt bầu 3 cm. Đường kính gốc thân được tính bằng trung bình cộng của 2 lần đo ở 2 vị trí vuơng gĩc.
- Số cặp lá (cặp lá/cây): đếm tồn bộ số cặp lá trên cây - Chiều dài lá (cm): đo từ gốc lá đến chĩp lá.
- Chiều rộng lá (cm): đo tại vị trí rộng nhất của lá.
- Diện tích lá (cm2/lá) : S= Kab (K = 0,66; a: chiều dài lá; b: chiều rộng lá) (Phan Văn Tân và Nguyễn Văn Thái, 2000) [25].
- Chiều dài rễ (cm): đo bằng thước cĩ khắc vạch, chính xác đến mm. - Khối lượng rễ tươi (g/bộ rễ): cân tồn bộ khối lượng bộ rễ của các cây đã chọn để theo dõi các chỉ tiêu trên.
- Khối lượng cây tươi (g/cây): cân tồn bộ khối lượng các bộ phận trên mặt đất của các cây đã chọn theo dõi các chỉ tiêu trên
- Hàm lượng đạm và lân trong lá (% chất khơ trong lá).
- Hàm lượng diệp lục chlorophyll a (Chla), chlorophyll b (Chlb) và carotenoid (Ccar) trong lá (mg/g lá tươi).
Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng tương hợp của các chủng vi khuẩn nội sinh chọn lọc trong điều kiện in vitro
Dựa vào kết quả thu được từ thí nghiệm 1, tuyển chọn 3 chủng cĩ ảnh hưởng tốt nhất đến sinh trưởng cây con cà phê vối để đánh giá khả năng tương hợp của chúng phục vụ cho các thí nghiệm ngồi đồng ruộng. Các chủng vi khuẩn được chọn để thực hiện thí nghiệm này gồm: B. subtilis EK17, B. pumilus BMT 4 và B. cereus M15.
Thử khả năng tương thích giữa các chủng vi khuẩn nội sinh chọn lọc bằng phương pháp cấy vạch vuơng gĩc trên mơi trường pepton. Cấy thẳng vạch vi khuẩn thứ nhất, sau đĩ cấy chủng vi khuẩn thứ hai vuơng gĩc với vạch thứ nhất. Các đĩa vi
khuẩn được nuơi giữ ở điều kiện nhiệt độ phịng trong vịng 72 giờ. Nếu tại điểm giao nhau của 2 vạch, vi khuẩn thứ nhất khơng mọc thì vi khuẩn thứ hai cĩ khả năng ức chế vi khuẩn thứ nhất (kết quả dương tính). Nếu tại điểm giao nhau của 2 vạch, vi khuẩn thứ hai mọc trên đường vạch của vi khuẩn thứ nhất thì vi khuẩn thứ hai cĩ khả xâm lấn vi khuẩn thứ nhất. Kết quả âm tính khi vi khuẩn thứ nhất vẫn phát triển bình thường tại điểm giao nhau của 2 vạch (Fukui et al., 1994) [76]. Chỉ thực hiện phối trộn các chủng cho kết quả âm tính (tương thích và khơng đối kháng với nhau).