4. Những đóng góp mới của luận án
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Loài cá Chình hoa (A. marmorata Quoy & Gaimard, 1824) phân bố ở tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam.
Ngành: Chordata
Lớp: Osteichthyes
Bộ: Anguilliformes Họ: Anguillidae
Giống: Anguilla
Loài: Anguilla marmorata Quoy & Gaimard, 1824 Tên gọi khác: Cá Chình bông, Chình cẩm thạch
Tên tiếng anh: Marbled eel, Gaint mottled eel
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác định thành phần loài cá Chình phân bố tại Thừa Thiên Huế bằng chỉ thị hình thái và phân tử.
- Nghiên cứu hiện trạng, đặc điểm môi trường và phân cụm sinh thái phân bố của cá Chình hoa ở Thừa Thiên Huế.
- Nghiên cứu đặc điểm và cấu trúc quần thể của cá Chình hoa ở tỉnh Thừa Thiên Huế dựa trên các chỉ thị hình thái.
- Đánh giá đa dạng di truyền quần thể cá Chình hoa ở tỉnh Thừa Thiên Huế bằng chỉ thị phân tử.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tiếp cận nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là loài cá Chình hoa (A. marmorata Quoy & Gaimard, 1824). Đây là loài cá có nhiều giá trị, tiềm năng cao và được coi là “loài bí
ẩn”, tuy nhiên chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều. Vì vậy, việc nghiên cứu đặc
điểm hình thái, phân bố và tính đa dạng di truyền của loài này là rất cần thiết. Những dẫn liệu ban đầu cho thấy loài này có khả năng sinh sống và di cư trên các thủy vực nước ngọt cho đến nước mặn ở đại dương. Do vậy, cần phải có thông tin khoa học đầy đủ về đặc điểm sinh học, sinh thái học, phân bố và di truyền của cá Chình hoa, từ đó có thể xác định được các kỹ thuật phát triển loài một cách có hiệu quả. Do đó, phương pháp tiếp cận nghiên cứu này như sau:
- Tiếp cận nơi phân bố tự nhiên của loài: mỗi một sinh vật nói chung, cá Chình hoa nói riêng đều có mối quan hệ mật thiết với điều kiện sinh thái nên việc thu thập các thông tin phải đảm bảo được các yếu tố tối thiểu cho sự tồn tại của loài.
- Tiếp cận theo nguyên tắc hệ thống: thông tin thu thập đầy đủ tất cả các mặt về đặc điểm hình thái, sinh thái môi trường, khả năng sinh trưởng, thích nghi nơi phân bố và các đặc điểm di truyền của loài.
- Tiếp cận trong thiết kế kỹ thuật phòng thí nghiệm, xử lý và phân tích thông tin liên quan đến đối tượng nghiên cứu. Ngoài ra, sử dụng các phương pháp tiếp cận trong từng nội dung nghiên cứu của luận án theo hướng tham khảo, kết thừa những nghiên cứu đi trước và thông tin từ người dân địa phương.
Xác định các vấn đề nghiên cứu
Thu thập thông tin
Tài liệu thứ cấp Điều tra hiện trường Kỹ thuật phòng thí nghiệm Điều Công Các kiện tự trình loại nhiên nghiên bản đồ
KVNC cứu Phân tích hìnhthái, phân tử
Tổng quan nghiên cứu Phân tích dữ liệu, GPS, GIS Thu thập dữ liệu môi trường Phỏng vấn hộ đánh bắt Thu thập mẫu vật
Hiện trạng phân bố, Thành phần Đặc điểm hình Đa dạng di đặc điểm môi trường, loài thái và cấu trúc truyền và phát
cụm sinh thái quần thể sinh quần thể
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu cụ thể
2.3.2.1. Phương pháp kế thừa số liệu thứ cấp
Kế thừa các kết quả nghiên cứu đã đạt được về giống cá Chình (Anguilla) ở trong và ngoài nước, bao gồm: đặc điểm phân bố, đặc điểm sinh học và sinh thái học, khả năng sinh trưởng, khả năng di cư của loài và sự đa dạng di truyền của loài; Ngoài ra, sử dụng các tài liệu về điều kiện tự nhiên của địa bàn nghiên cứu.
2.3.2.2. Phỏng vấn thu thập thông tin
Dựa trên các thông tin được tổng hợp từ quá trình tổng quan tài liệu nghiên cứu về hiện trạng phân bố và sự xuất hiện của cá Chình hoa trên các thủy vực ở Thừa Thiên Huế, đề tài đã thực hiện các cuộc khảo sát thực địa để xác định vùng nghiên cứu và vị trí thu mẫu. Các số liệu cơ bản về nguồn lợi cá Chình hoa như: môi trường phân bố, mùa vụ xuất hiện, năng suất, ngư cụ khai thác ... Các thông tin này được thu thập bằng phương pháp phỏng vấn (cấu trúc và phỏng vấn sâu/nghiên cứu trường hợp) từ các ngư dân khai thác nguồn lợi tại các vùng sinh thái khác nhau thuộc địa phận tỉnh Thừa Thiên Huế. Kết quả khảo sát đã xác định được 07 tuyến nghiên cứu là những thủy vực có tính đại diện, đặc trưng về phân bố của cá Chình hoa tại Thừa Thiên Huế (Hình 2.3). Tại các vùng nghiên cứu, đề tài đã thực hiện phỏng vấn cấu trúc với 750 hộ và phỏng vấn sâu 15 hộ (Phụ lục 6). Các sổ nhật ký (Phụ lục 2) được cung cấp cho ngư dân nhằm thu thập thông tin định kỳ 15 ngày/lần.
2.3.2.3. Thu mẫu
Hiện nay, hệ thống phân loại bằng các chỉ số hình thái được xây dựng bởi Ege (1939) [102] và Watanabe (2003) [231], vẫn là phương pháp nhanh nhất và được sử dụng phổ biến. Sự chồng chéo các đặc điểm hình thái và sự biến đổi màu sắc theo giai đoạn phát triển ở cá Chình là rất đa dạng [102], [232], [197]. Cho nên sử dụng phương pháp phân tích phân tử kết hợp với phân tích hình thái sẽ giúp xác định loài một cách chính xác hơn [197]. Trong số 16 loài và 3 phân loài cá Chình thuộc giống Anguilla đã được xác định, có hai loài là cá Chình hoa (A. marmorata Quoy & Gaimard, 1842) và cá Chình mun (A. bicolor pacifica McClelland, 1844) đã được tìm thấy ở Thừa Thiên Huế [20]. Cá Chình hoa là loài có phân bố phổ biến và có giá trị kinh tế cao hơn [19]. Trước khi thực hiện quá trình thu mẫu phục vụ cho nghiên cứu về đặc điểm hình thái và phân tích đa dạng di truyền của cá Chình hoa, để đảm bảo độ chính xác về thành phần loài của các mẫu vật thu được, chúng tôi đã lựa chon 6 mẫu vật thuộc hai loài cá Chình phân bố tại Thừa Thiên Huế để định danh bằng chỉ thị hình thái theo mô tả của Ege (1939) [102] và Watanabe và cs (2004) [232] và phân tử bằng kỹ thuật DNA barcode [195]. Các mẫu vật nghiên cứu được lựa chọn bao gồm, 05 cá thể cá Chình hoa có kích cỡ khác nhau từ 34,0 – 3.200,0 g (255,0 – 1.080,0 mm) nhằm loại bỏ sự sai số liên quan đến các khác biệt hình thái qua các giai đoạn phát triển và 01 cá thể cá Chình mun để làm rõ sự khác biệt về hình thái và phân tử giữa hai loài.
Bảng 2.1. Tuyến nghiên cứu và số lượng mẫu vật thí nghiệm
Tuyến nghiên cứu Hình thái Giải phẩu Phân tử
STT Thủy vực Ký Số lượng Ký hiệu* Số Kí hiệu* Số Kí hiệu*
hiệu lượng lượng
1 Sông Ô Lâu OL 34 PD (1 – 34) 26 PD (02 – 17, 19 – 25, 28, 29, 31, 33) 14 HuePD (2 – 10, 12, 13, 15, 19, 21) AL (01, 03 – 05, 07, 09, 10, 13, 14, Hệ thống AL (01 – 52) 16, 17, 20 – 22, 24, 25, 29, 33, 35, Hue DTL (01 - 05, 2 SHU 105 SBO (1 – 21) 64 36, 43, 44, 48); 10 sông Hương 10, 13, 21, 25, 28) DTL (01 – 32) SBO (01 – 03, 05, 08,14, 16 – 19, 21); DTL (01 – 23, 25 – 31) DTR (01 – 20) DTR (01 – 07, 0 –11, 15, 16, 18–20)
3 Sông Truồi STr 49 38 ND (01 – 08, 09 – 16, 19 – 23, 24, 14 HueDTR (01-05)
ND (01 – 29) 25, 27, 29) SBL (01 - 33) PL (01, 02, 10 – 13, 19, 20, 24); HueBL (01, 02, 4 Sông Bù Lu SBL 57 30 BL (01- 08, 11, 14, 15, 18, 20 – 25, 8 07, 08, 15, 18, 20, PL (01 – 24) 27, 28, 33) 22) 5 Đầm Lăng LC 45 LC (01 – 45) 15 LC (01 – 04, 07, 09, 15, 21 – 23, 25, 2 HueLC 01, Cô 36, 38, 44, 45) HueLC 02 6 Cửa biển TA 30 TA (01 - 30) 9 TA (01, 03, 05, 07, 14 – 16, 21, 28) 0 Thuận An
7 Cửa biển Tư TH 30 TH (01 - 30) 7 TH (01, 02, 06, 12, 16, 18, 22) 0 Hiền
Tổng 350 189 48
Trong thời gian từ tháng 8/2018 đến tháng 5/2019, 350 mẫu cá Chình hoa có khối lượng từ 3,0 – 4.500,0 g tương ứng với chiều dài từ 120,0 – 1.136,9 mm đã thu thập được trên 7 tuyến nghiên cứu. Mẫu cá Chình hoa được thu thập phải có hình thái nguyên vẹn, tươi. Mẫu được đính kèm Etiket với các thông tin về tên loài, tên địa phương, ngày tháng năm, người thu mẫu, địa điểm thu mẫu và tiến hành chụp ảnh mẫu vật. Mẫu vật được bảo quản trong ethanol 95 % ở - 20 oC trước khi phân tích. Dựa trên kết quả phân tích đặc điểm hình thái ngoài của 350 mẫu cá Chình hoa thu được, chúng tôi lựa chọn những mẫu vật ở các kích cỡ hoặc giai đoạn phát triển đại diện cho vùng phân bố ở các hệ sinh thái (hạ lưu, trung lưu và thượng lưu) của các thủy vực nghiên cứu để giải phẩu hình thái nội quan (189 mẫu) và phân tích phân tử (48 mẫu). Số lượng, ký hiệu, đặc điểm hình thái và phân bố của các mẫu vật được thể hiện ở Bảng 2.1, Phụ lục 1 và Phụ lục 3.
2.3.2.4. Phương pháp xác định các thông số môi trường và vẽ bản đồ
Các thông tin về môi trường phân bố được thu thập trực tiếp tại hiện trường. Trong đó, các yếu tố môi trường nhiệt độ, độ mặn, pH, DO được xác định bằng máy đo chuyên dụng; độ sâu được đo bằng đĩa Sachi; các thông tin về nền đáy, chế độ thủy triều, chu kì trăng, thời tiết, thời gian được xác định thông qua quan sát và dữ liệu khí tượng, thủy văn (Bảng 2.2). Dùng máy ảnh để chụp khi quan sát, ghi nhật ký nghiên cứu, lập phiếu theo dõi để ghi lại kết quả tại thực địa.
Bảng 2.2. Các thông số về môi trường và thiết bị thu thập thông tin
STT Thông số Phương pháp xác định Thiết bị
1 Nhiệt độ Đo trực tiếp Nhiệt kế đầu dò
2 Độ mặn Đo trực tiếp Khúc xạ kế ATAGO Master S/MillM
3 DO Đo trực tiếp Máy Extech DO600
4 pH Đo trực tiếp Máy Hanna HI98017
5 Độ sâu Đo trực tiếp Đĩa Sachi
6 Nền đáy Xác định trực tiếp Máy ảnh và sổ ghi chép 7 Màu nước Xác định trực tiếp Máy ảnh và sổ ghi chép 8 Chu kì trăng Xác định trực tiếp Lịch và sổ ghi chép 9 Thời gian Xác định trực tiếp Đồng hồ và sổ nhật ký 10 Chế độ thủy triều Xác định trực tiếp Lịch và sổ ghi chép
11 Toạ độ Xác định trực tiếp Máy định vị GPS Garmin78S
Từ việc khảo sát thực địa, lấy thông tin khu vực khai thác và phân bố của cá Chình hoa thuộc lưu vực của 5 hệ thống sông chính, hai cửa biển và đầm Lăng Cô ở Thừa Thiên Huế. Sử dụng máy định vị GPS để đánh dấu các vị trí thu mẫu và khai thác cá Chình hoa kết hợp với dữ liệu vệ tinh google map và phần mền ArcGIS ver 10.3 được sử dụng để biên tập các bản đồ chuyên đề.
2.3.2.5. Phương pháp phân tích đặc điểm hình thái
Các chỉ số về màu sắc, hình dạng bên ngoài của cá Chình hoa được quan sát, ghi chép ngay trên thực địa. Trong tổng số 21 chỉ số đo về hình thái bên ngoài có 11 chỉ số được đo bằng cách sử dụng mặt trái của cơ thể hoặc mặt sau của đầu Watanabe và cs (2004) [232], (Hình. 2.4). Các chỉ số về chiều dài tổng (TL), chiều dài đầu (LH), khởi điểm vây lưng (PD), khởi điểm vây hậu môn (PA), đường kính mắt (E) và khoảng cách giữa 2 mắt (IO) đã được đo bằng thước có độ chính xác 1,0 mm và thước kẹp có độ chính xác 0,01 mm. Khoảng cách vây lưng và vây hậu môn (AD), khoảng cách từ vây ngực đến vây lưng (PDH), chiều dài vây đuôi (T), chiều dài thân (TR) được tính từ PA, PD, LH và LT. Tổng cộng có 10 ký tự được tiêu chuẩn hóa theo tỷ lệ LT và HL để so sánh giữa các mẫu [102], [238] và (Hình 2.4). Các chỉ số màu sắc, hình dạng bên ngoài của cá Chình hoa được phân loại theo 4 giai đoạn (Bảng 2.3).
Hình 2.4. Các chỉ số hình thái được sử dụng theo mô tả của Watanabe (2004) [238]
(a) các chỉ số: chiều dài tổng (TL), chiều dài đầu (LH), khởi điểm vây lưng (PD), khởi điểm vây hậu môn (PA), khoảng cách vây lưng và vây hậu môn (AD), khoảng cách từ vây ngực đến vây lưng (PDH), chiều dài vây đuôi (T), Chiều dài thân (TR); (b): đường kính mắt (E); (c): khoảng cách giữa 2 mắt (IO)
Bảng 2.3. Các đặc điểm hình thái và màu sắc ngoài của cá Chình hoa
STT Chỉ tiêu
1 Cơ thể có màu vàng, lưng có dãi nâu, đốm chưa rõ; Vây vàng nhạt gần như trong suốt 2 Cơ thể có màu vàng, có đốm hoa màu xám rõ; Vây màu vàng.
3 Lưng nâu, đốm hoa rõ, màu xám, bụng xám trắng; Vây màu vàng nâu. 4 Lưng vàng nâu, đốm đen, bụng và đuôi vàng; Vậy màu đen hoặc đen đỏ
Các chỉ số hình thái bên trong bao gồm: đặc điểm mang, răng, miệng, nội quan, tuyến sinh dục được mô tả, đo, đếm bằng phương pháp quan sát, giải phẩu 189 cá thể trên tổng số 350 cá thể. Tiến hành đếm số lượng tia vây ngực, số đốt sống. Cỡ miệng được đo và tính toán theo công thức được đề xuất bởi Shirota (1970) [201]:
MH=AB*√2(1)
Tỷ lệ giữa chiều dài ruột và chiều dài tổng được tính theo công thức của Al- Hussainy (1949, trích dẫn bởi Phạm Thanh Liêm và Trần Đắc Định, 2004) [23]:
RLG = Li / TL (2)
Trong đó, Li là chiều dài ruột, TL là chiều dài toàn thân. Công thức này được áp dụng đối với tỷ lệ giữa chiều dài dạ dày và chiều dài tổng.
Mối tương quan giữa chiều dài và trọng lượng là được tính theo công thức của Froese và cs, (2014) [106]:
W = a.Lb (3)
Trong đó, W là khối lượng cơ thể (g), “L” là tổng chiều dài cơ thể (mm), “a” là hằng số tăng trưởng ban đầu, “b” là hệ số tăng trưởng.
2.3.2.6. Phương pháp phân tích phân tử
DNA tổng số của các mẫu cá Chình hoa được tách chiết theo mô tả của Kumar và cs (2007) [141] có sửa đổi. Cắt nhỏ 200 mg mẫu cơ cho vào ống eppendorf (1,5 ml) và tái huyền phù trong 940 µl dung dịch phá vở tế bào (200 mM Tris-HCl (pH = 8), 100 mM EDTA, 150 mM NaCl), 30 µl 20 % SDS và 30 µl proteinase K (10 mg/ml), vontex trong 30 giây. Hỗn hợp được ủ lắc 55°C trong thời gian 5 - 10 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục bổ sung 300 µl 7,5 M amonium acetate, vontex trong 15 giây và ủ trong đá lạnh 3 giờ, ly tâm 15.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 4 °C, thu dịch nổi chuyển sang một ống eppendorf mới. Tiếp tục bổ sung một thể tích P.C.I (phenol : chloroform : isoamine theo tỉ lệ 25 : 24 : 1) vào dịch nổi trên, đảo đều, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 4 ºC, thu dịch nổi (lặp lại 2 lần). Bổ sung 2 thể tích ethanol 100 % và ủ nhiệt độ - 20 ºC trong 20 phút, sau đó ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 4ºC. Loại bỏ dịch nổi, thu và rửa kết tủa bằng 500 µl ethanol 70 %, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 4 ºC. Loại bỏ dịch nổi làm khô kết tủa ở nhiệt độ phòng sau đó hòa tan kết tủa với 50 µl H2O, ủ mẫu ở nhiệt độ 37 ºC cho đến khi kết tủa tan hết. Sau đó kiểm tra chất lượng DNA bằng cách chạy điện di trên gel agarose 0,1 % với đệm được sử dụng là TAE 1X (Tris - acetate 40 mM + EDTA 1 mM) ở 100 vòng trong khoảng 20 phút. Gel được nhuộm bằng dung dịch EtBr với nồng độ 0,5 µg/ml trong 15 phút, rửa gel bằng nước cất trong 10 phút. Gel được quan sát bằng hệ thống phân tích hình ảnh Gel Documention.
Phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để phân lập các đoạn gen barcode từ các mẫu cá Chình. Trong đó cặp mồi của phân đoạn gen COI được thiết kế cùng với các cặp mồi được công bố trên các tạp chí và ngân hàng barcode của thế giới CBOL (Consortium for the Barcode of Life) cũng như ngân hàng barcode của Việt Nam. Cặp mồi của đoạn gen 16S rRNA được tham khảo theo mô tả của Palumbi và cs (1991) [178]. Trình tự của các đoạn mồi được thể hiện trong Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Trình tự đoạn mồi sử dụng để khuếch đại đoạn gen COI và 16S rRNA
Đoạn gen Chỉ thị đoạn mồi Trình tự đoạn mồi (5´- 3´) Nguồn
COI A.angFw-1 GCACTAAGCCTTCTAATCC Nghiên cứu
A.angRv-1 GATGATTATTGTGGCAGAAG này
16S rRNA L2510 CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT Palumbi và cs
H3080 CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T (1991) [178] Phản ứng PCR được tiến hành theo mô tả của Sambrook và cs (1989) [194]. Thành phần phản ứng: 1 µL DNA tổng số, 1 µL l mồi xuôi (10 mM), 1 µL mồi ngược (10 mM), 7 µL đệm PCR (10X), 0,5 µL dNTP (10 mM), 0,2 µL Enzyme Taq (5 UI/µL) và bổ sung nước cất vô trùng cho đủ thể tích 35 µL. Khuếch đại PCR được thực hiện trên máy (MJ- MiniTM Persanol Thermal Cycle, Bio-Rad) theo chu trình luân nhiệt như sau: 95 oC / 5 phút; tiếp đến là 30 chu kỳ: 95 oC / 45 giây, 51 oC / 30 giây, và 72 oC / 1 phút; cuối cùng là 72 oC / 7 phút cho gen COI và 95 ºC / 5 phút; (95 ºC / 45 giây; 46 ºC / 45 giây; 72 ºC /