4. Những đóng góp mới của luận án
2.3.2.6. Phương pháp phân tích phân tử
DNA tổng số của các mẫu cá Chình hoa được tách chiết theo mô tả của Kumar và cs (2007) [141] có sửa đổi. Cắt nhỏ 200 mg mẫu cơ cho vào ống eppendorf (1,5 ml) và tái huyền phù trong 940 µl dung dịch phá vở tế bào (200 mM Tris-HCl (pH = 8), 100 mM EDTA, 150 mM NaCl), 30 µl 20 % SDS và 30 µl proteinase K (10 mg/ml), vontex trong 30 giây. Hỗn hợp được ủ lắc 55°C trong thời gian 5 - 10 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục bổ sung 300 µl 7,5 M amonium acetate, vontex trong 15 giây và ủ trong đá lạnh 3 giờ, ly tâm 15.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 4 °C, thu dịch nổi chuyển sang một ống eppendorf mới. Tiếp tục bổ sung một thể tích P.C.I (phenol : chloroform : isoamine theo tỉ lệ 25 : 24 : 1) vào dịch nổi trên, đảo đều, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 4 ºC, thu dịch nổi (lặp lại 2 lần). Bổ sung 2 thể tích ethanol 100 % và ủ nhiệt độ - 20 ºC trong 20 phút, sau đó ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 4ºC. Loại bỏ dịch nổi, thu và rửa kết tủa bằng 500 µl ethanol 70 %, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 4 ºC. Loại bỏ dịch nổi làm khô kết tủa ở nhiệt độ phòng sau đó hòa tan kết tủa với 50 µl H2O, ủ mẫu ở nhiệt độ 37 ºC cho đến khi kết tủa tan hết. Sau đó kiểm tra chất lượng DNA bằng cách chạy điện di trên gel agarose 0,1 % với đệm được sử dụng là TAE 1X (Tris - acetate 40 mM + EDTA 1 mM) ở 100 vòng trong khoảng 20 phút. Gel được nhuộm bằng dung dịch EtBr với nồng độ 0,5 µg/ml trong 15 phút, rửa gel bằng nước cất trong 10 phút. Gel được quan sát bằng hệ thống phân tích hình ảnh Gel Documention.
Phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để phân lập các đoạn gen barcode từ các mẫu cá Chình. Trong đó cặp mồi của phân đoạn gen COI được thiết kế cùng với các cặp mồi được công bố trên các tạp chí và ngân hàng barcode của thế giới CBOL (Consortium for the Barcode of Life) cũng như ngân hàng barcode của Việt Nam. Cặp mồi của đoạn gen 16S rRNA được tham khảo theo mô tả của Palumbi và cs (1991) [178]. Trình tự của các đoạn mồi được thể hiện trong Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Trình tự đoạn mồi sử dụng để khuếch đại đoạn gen COI và 16S rRNA
Đoạn gen Chỉ thị đoạn mồi Trình tự đoạn mồi (5´- 3´) Nguồn
COI A.angFw-1 GCACTAAGCCTTCTAATCC Nghiên cứu
A.angRv-1 GATGATTATTGTGGCAGAAG này
16S rRNA L2510 CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT Palumbi và cs
H3080 CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T (1991) [178] Phản ứng PCR được tiến hành theo mô tả của Sambrook và cs (1989) [194]. Thành phần phản ứng: 1 µL DNA tổng số, 1 µL l mồi xuôi (10 mM), 1 µL mồi ngược (10 mM), 7 µL đệm PCR (10X), 0,5 µL dNTP (10 mM), 0,2 µL Enzyme Taq (5 UI/µL) và bổ sung nước cất vô trùng cho đủ thể tích 35 µL. Khuếch đại PCR được thực hiện trên máy (MJ- MiniTM Persanol Thermal Cycle, Bio-Rad) theo chu trình luân nhiệt như sau: 95 oC / 5 phút; tiếp đến là 30 chu kỳ: 95 oC / 45 giây, 51 oC / 30 giây, và 72 oC / 1 phút; cuối cùng là 72 oC / 7 phút cho gen COI và 95 ºC / 5 phút; (95 ºC / 45 giây; 46 ºC / 45 giây; 72 ºC / 1 phút) x 30 chu kỳ và 72 ºC trong 10 phút, cuối cùng giữ
ở 4 ºC cho gen 16S rRNA. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 % trong đệm TAE 1X với thuốc nhuộm Ethydium bromide và đọc hình ảnh điện di bằng hệ thống đọc UV trực tiếp (UV- transillumnatorr, Model: DyNa Light).
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kít Kit Isolate II PCR and Gel (Bioline) theo hướng dẫn của nhà sản xuất: pha loãng sản phẩm PCR cần được tinh sạch với 50 – 100 µL nước. Sau đó bổ sung dịch gắn kết CB (Gel Binding) vào cột tinh sạch có thể tích 2 mL theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB là 1 : 2. Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA và ly tâm 11.000 vòng/phút (v/p) trong 30 giây và loại bỏ dịch chảy qua cột. Tiếp tục bổ sung đệm rửa 700 µl Washing Buffer CW vào cột liên kết, ly tâm 11.000 v/p trong 30 giây và loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút để loại đệm Washing Buffer CW và làm khô màng bằng cồn ethanol. Chuyển cột sang ống Eppendorf mới 1,5 ml. Bổ sung 15 - 30 µl nước khử ion khử trùng (Elution Bufer C directly), để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 11.000 vòng trong 1 phút để thu mẫu DNA.
Các sản phẩm PCR của vùng gen COI và 16S rRNA sau đó được giải trình tự trực tiếp bằng phương pháp Sanger dựa trên nguyên lý dideoxy terminator [195] trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại Công ty Maccrogen, Hàn Quốc. Thành phần của phản ứng bao gồm: enzyme DNA polymerase, primer, trình tự DNA, 4 loại deoxy nucleotid DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 4 loại dideoxy nucleotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) được đánh dấu đồng vị phóng xạ. Các deoxy nucleotide là những nucleotid đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường. Nhóm 3’- OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi cho nên khi một ddNTP được thêm vào thì một nucleotide không được gắn vào chuỗi, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu
gắn các ddNTP vào chuỗi. Sau phản ứng tổng hợp, các đoạn DNA có độ dài khác nhau được hình thành do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA và vị trí các vạch quan sát được trên bản gel để xác định trình tự các nucleotide theo chiều từ 5’ – 3’ từ dưới lên trên [195]. Phương pháp này thường được sử dụng để giải trình tự các đoạn DNA ngắn từ 400 - 900 bp [157].