Việc chẩn ựoán cúm gia cầm do nhiễm virus type A chủ yếu là phải phân lập và ựịnh danh virus kết hợp với chẩn ựoán dựa trên triệu chứng lâm sàng, xác ựịnh tổn thương ựại thể, vi thể, dịch tễ học và một số phản ứng huyết thanh học.
Theo chẩn ựoán thường quy của Trung tâm chẩn ựoán thú y Trung ương Ờ Cục thú y, sơ ựồ chẩn ựoán phòng thắ nghiệm của bệnh cúm hiện nay như sau:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 23
* Phân lập virus
Là một chẩn ựoán cơ bản, có ý nghĩa quyết ựịnh. để phân lập virus, thường sử dụng mẫu bệnh phẩm là phổi, khắ quản, não, lách. Việc phân lập ựược thực hiện trên môi trường tế bào dòng thận chó MDCK hoặc trên phôi trứng gà. * Phân lập virus trên môi trường tế bào
-Subtype H -Subtype H -ELISA
-Subtype N -Subtype N -AGP
-HI Giám ựịnh Phân lập virus: trên trứng hoặc tế bào HI test Bệnh phẩm Tìm kháng thể cúm Phủ tạng: Phổi, khắ quản, ganẦ Huyết thanh RT-PCR Dịch họng, ổ nhớp Xét nghiệm nhanh: BD Dir hoặc Quickvue NI test
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 24 để có thể lây nhiễm bệnh phẩm trên môi trường tế bào, trước hết phải thực hiện nuôi cấy tế bào trên chai T Ờ 25 trong môi trường phát triển tế bào với các hóa chất, nguyên vật liệu cần thiết. Sau khi thảm tế bào mọc từ trên 90% sau 24 Ờ 72h có thể sử dụng phân lập virus bằng việc tiêm truyền huyễn dịch bệnh phẩm ựã xử lý kháng sinhhoặc qua lọc trên bề mặt tế bàọ Quá trình lây nhiễm bệnh phẩm ựược bổ sung môi trường nuôi cấy virus (D Ờ MEM với TCPK treaed trypsine) trong tủ ấm CO2. Tiến hành quan sát bệnh tắch tế bào CPE hàng ngàỵ
Có thể thu hoạch dịch nổi trong chai tế bào ựã cấy virus sau 1 - 7 ngày ựể kiểm tra bằng phản ứng HẠ Nếu âm tắnh có thể cấy chuyển trên tế bào thêm 2 Ờ 3 lần. Mẫu phân lập trên tế bào ựược bảo quản trong tủ -70oC.
* Phân lập virus trên phôi trứng
Sử dụng trứng gà 9 Ờ 11 ngày tuổi ựể phân lập virus. Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm cho 3 trứngvà ựược ấp ở 37oC trong 7 ngàỵ
Trước khi thu hoạch nước trứng phải cất trứng vào tủ lạnh 4oC trong 4h hoặc ựể ở tủ âm trong 20 phút ở nhiệt ựộ -20oC. Nước trứng (nước niệu mô phôi trứng) ựược cho vào ống nghiệm 10ml và bảo quản ở tủ -70oC.
Mẫu phân lập ựược kiểm tra bằng phản ứng HA, nếu âm tắnh có thể cấy chuyển trên phôi trứng gà thêm 2 Ờ 3 ựợt.
* định danh virus
Sau khi phân lập ựược virus từ môi trường tế bào hoặc trên phôi trứng gà, có thể giám ựịnh virus bằng các HI test ựể giám ựịnh subtype H; NI test ựể xác ựịnh subtype N hoặc bằng phương pháp RT-PCR ựể xác ựịnh subtype H, N.
Phản ứng huyết thanh học ựược dùng ựể nhận biết các kháng thể có từ 7 Ờ 10 ngày sau khi nhiễm virus. Tắnh ựa dạng của kháng nguyên bề mặt của virus cúm type A ựã ảnh hưởng rất lớn ựến việc áp dụng các phương pháp huyết thanh học truyền thống ựể chẩn ựoán bệnh.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 25 Trong thực tế có thể sử dụng các phản ứng huyết thanh sau ựể tìm kháng thể cúm: HI, ELISA, AGP.
* Sử dụng xét nghiệm nhanh BD Dir hoặc Quickvue
Phương pháp BD Direc Ờ antigene TM Flu A+B là phương pháp xét nghiệm màng miễn dịch nhanh ựể phát hiện trực tiếp và ựịnh tắnh của kháng nguyên virus cúm type A và B có trong dịch rửa hầu họng. Phương pháp này chỉ có thể phân biệt ựược kháng nguyên cúm type A và type trong xét nghiệm.