Immonohistochemistry):
Ở mỗi ca bệnh, chọn ra những con có triệu chứng ựiển hình và tổn thương ựại thể ựặc trưng ựể nhuộm tiêu bản bằng phương pháp hóa mô miễn dịch.
* Nguyên lý: sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể ựặc hiệu * Tiến hành:thắ nghiệm bao gồm 5 lô mẫu, mỗi lô nhuộm 8 tiêu bản. - Cắt lát tiêu bản dày 4 ộm, gắn cố ựịnh lát cắt vào phiến kắnh sạch - Làm khô trong tủ ấm 40oC qua ựêm, sau ựó ựể 10 phút ở 60 oC
- Ngâm trong 3 cốc Xylen, sau ựó cho vào 3 cốc cồn tuyệt ựối, 1cốc cồn 70 oC (mỗi cốc hóa chất ngâm trong 3-5 phút).
- Rửa dưới vòi nước chảy trong 3-5 phút. Cho tiêu bản vào trong nước cất nếu cần thiết.
- Cho các phiến kắnh (ựã gắn tiêu bản) vào giá ựể tiêu bản, nhúng vào dung dịch TRIS buffer.
- Nhỏ 200 ộl H2O2 3% lên các phiến kắnh, ựể ủ trong 10 phút. - Rửa bằng TRIS buffer.
- Nhỏ 200 ộl protein K, ựể 5 phút - Rửa bằng TRIS buffer
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 38 - Nhỏ 200 ộl kháng thể 1 (pha bằng đ sữa tách bơ 1%, tỷ lệ theo hướng dẫn của nguyên liệu), ựể ủ trong 1 giờ
- Rửa bằng TRIS buffer
- Nhỏ 200 ộl kháng thể 2, ựể ủ trong 45 phút - Rửa bằng TRIS buffer
- Nhỏ 200 ộl đ AEC. để ủ trong 3-5 phút, rửa nước cất.
- Kiểm tra các phiến kắnh ựã nhỏ AEC dưới kắnh hiển vi, xem ựạt yêu cầu chưa (nếu có màu nâu ựỏ thì ựạt yêu cầu), nếu không ựạt thì tăng thêm thời gian ủ với AEC
- Rửa bằng nước cất
- Nhuộm Hematoxylin trong 3 phút (hoặc Methyl blue) - Rửa dưới vòi nước chảy
- Rửa dười vòi nước cất
Dán lamen lên tiêu bản ựể bảo quản.
(Ghi chú: dung dịch sữa tách bơ 1%: 0.1g skim milk trong 9ml dung dịch TRIS buffer, pH dung dịch TRIS buffer: 7.2 là tốt nhất (phải kiểm tra trước khi sử dụng, dung dịch, H2O2 3%: 9ml nước cất và 1ml BDH Hydrogen peroxide 30%, nhiệt ựộ ủ là nhiệt ựộ phòng thắ nghiệm)
*đọc kết quả:
Soi các tiêu bản ựã nhuộm dưới kắnh hiển vi quang học, căn cứ vào sự lên màu ựể phân chia làm 03 mức ựộ khác nhau:
đám, ựiểm bắt màu nâu ựỏ ắt: dương tắnh yếu (+)
đám, ựiểm bắt màu nâu ựỏ nhiều: dương tắnh mạnh (+++) đám, ựiểm bắt màu nâu ựỏ trung bình: dương tắnh vừa (++) Không xuất hiện màu nâu ựỏ: âm tắnh (-)
3.3.5. Phương pháp thống kê sinh học:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 39
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH DỊCH CÚM GIA CẦM Ở MỘT SỐ đỊA PHƯƠNG TRONG 02 NĂM NGHIÊN CỨU (NĂM 2010-2011) NĂM NGHIÊN CỨU (NĂM 2010-2011)
Trong năm 2010: theo báo cáo về tình hình diễn biến dịch cúm gia cầm của Cục thú y, dịch cúm gia cầm H5N1 ựã xảy ra ở diện rộng với 23 tỉnh thành trong cả nước và xảy ra cả trên 3 ựối tượng: gà, ngan, vịt. Diễn biến ựược thể hiện trong bảng 4.1.a sau:
Bảng 4.1.ạ Tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 năm 2010 TT Tỉnh Số huyện Số xã Gà bệnh (con) Vịt bệnh (con) Ngan bệnh (con) Gà hủy (con) Vịt hủy (con) Ngan hủy (con) 1 Bắc Kạn 1 2 357 4 5.075 171 2 Bắc Ninh 1 1 400 400 3 Bến Tre 1 1 768 606 4 Cà Mau 5 12 2.665 5.123 44 3.297 5.472 44 5 đắk Lắk 3 3 150 4.050 60 150 4.200 60 6 điện Biên 1 3 6.652 65 7.622 7 đồng Tháp 1 1 210 210 8 Hà Giang 1 1 139 139 9 Hà Tĩnh 3 9 1.198 4.856 127 5.253 8.593 353 10 Khánh Hòa 2 4 1.233 37 1.254 71 11 Kon Tum 1 2 533 814 64 533 1.273 64 12 Lạng Sơn 1 1 120 120 13 Nam định 2 2 20 1.845 20 1.845 14 Nghệ An 4 6 240 2.912 4.012 3.434 15 Quảng Nam 1 1 205 6.320 205 6.320 16 Quảng Ngãi 1 2 2.547 8.070 17 Quảng Ninh 3 5 5.020 2.924 5.020 2.924 18 Quảng Trị 2 3 1.992 4.137 19 Sóc Trăng 2 3 299 2.129 299 2.129 20 Thái Nguyên 1 2 679 679 21 Tuyên Quang 2 2 463 400 844 400 17 22 Gia Lai 1 1 1.270 150 480 1.270 150 480 23 Thái Bình 1 1 310 310 Tổng số 41 68 14.712 44.318 779 28.356 58.045 1.189
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 40 Như vậy, số gà mắc bệnh cúm lên tới 14. 712 con, số lượng ắt hơn ở vịt (44.318 con) và cao hơn ở ngan (779 con). Có sự chênh lệch này không có nghĩa là gà ắt mẫn cảm hơn vịt mà phụ thuộc vào ựặc ựiểm ựiều kiện tự nhiên của từng ựịa phương dẫn ựến quy mô và loài gia cầm, thủy cầm khác nhaụ Cục thú y cho rằng dịch cúm gia cầm phát ra lẻ tẻ, rải rác. Các ổ dịch xảy ra chủ yếu trên ựàn gia cầm không tiêm phòng vaccine chiếm 44,59%, ựàn mới tiêm phòng 1 mũi chiếm 16,21%, số còn lại (39,2%) không có thông tin. Toàn bộ các ổ dịch phát ra là ở loại hình gia trại hoặc hộ gia ựình chăn nuôi nhỏ lẻ, quy mô dưới 100 con chiếm 13,51%, quy mô dưới 2000 con chiếm 78,37%.
Trong năm 2011, dựa vào các mẫu gửi về Trung tâm chẩn ựoán Thú y trung ương, chúng tôi thống kê số ca bệnh mắc cúm gia cầm. Kết quả ựược thể hiện ở bảng 4.1.b dưới ựây:
Bảng 4.1.b. Thống kê số mẫu cúm gia cầm H5N1 tới tháng 7 năm 2011
TT Ngày/tháng Tỉnh/thành phố Loài vật Số mẫu Kết quả
1 6/1 Bắc Kạn Vịt 3 (+) 3/3H5N1 2 13/1 Nam định Vịt 3 (+) 3/3 H5N1 3 19/1 Hà Nội Gà 1 (+) 1/1 H5N1 4 8/2 Nam định Vịt 3 (+) 3/3 H5N1 5 9/2 Lạng Sơn Gà 3 (+)2/2 H5N1 6 11/2 Nam định Vịt 3 (+) 3/3 H5N1 7 19/2 Hà Nội Gà 4 (+) 4/4 H5N1 8 23/2 Vĩnh Phúc Vịt 3 (+) 1/3 H5N1 9 25/2 Vĩnh Phúc Gà 3 (+) 3/3H5N1 10 1/3 Ninh Bình Gà 9 (+) 2/9 H5N1 11 1/3 Hà Nội Vịt 3 (+) 3/3 H5N1 12 2/3 Tuyên Quang Gà 4 (+) 4/4 H5N1 13 7/3 Tuyên Quang Gà 7 (+) 1/7 H5N1 14 18/3 Nam định Gà 4 (+) 4/4 H5N1 15 29/3 Nam định Gà 3 (+) 3/3 H5N1 16 4/4 Bắc Kạn Gà 3 (+) 3/3 H5N1 17 5/4 Hà Nam Vịt 6 (+) 6/6 H5N1 18 15/4 Hà Nam Vịt 3 (+) 1/3 H5N1 19 15/4 Hà Nam Gà 6 (+) 2/6 H5N1 20 25/4 Hà Nội Ngan 3 (+) 3/3 H5N1 21 15/7 Phú Thọ Vịt 1 (+) 1/1 H5N1 22 15/7 Phú Thọ Gà 1 (+) 1/1 H5N1 23 18/7 Phú Thọ Gà 1 (+) 2/5 H5N1 24 18/7 Phú Thọ Vịt 4 (+) 2/5 H5N1 25 20/7 Phú Thọ Vịt 4 (+) 4/4 H5N1
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 41 Qua bảng 4.1.2 cho thấy, dịch cúm gia cầm vẫn xảy ra ở một số tỉnh (thành phố) như: Hà Nội, Bắc Kạn, Nam định, Phú Thọ, Hà Nam, Tuyên Quang, Ninh Bình và chủ yếu vẫn là chủng virus H5N1 lưu hành. Trong các mẫu gửi về Trung tâm chẩn ựoán thì gà vẫn chiếm số lượng lớn hơn ngan và vịt.
Như vậy, dịch cúm gia cầm vẫn xảy ra nhỏ lẻ ở một số ựịa phương có quy mô chăn nuôi nông hộ chiếm ưu thế.
4.2. MỘT SỐ TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG Ở GÀ MẮC BỆNH CÚM
Mẫu gà nguyên con mắc bệnh cúm từ các ổ dịch ở các tỉnh, thành phố gửi về Trung tâm Chẩn ựoán Thú y trung ương ựể xét nghiệm. Kết quả cho thấy các mẫu gửi xét nghiệm ựều dương tắnh với virus cúm gia cầm H5N1.
Các triệu chứng lâm sàng trên gà trong các ổ dịch tự nhiên ựã ựược theo dõi, quan sát và tổng hợp lại ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Triệu chứng lâm sàng ở gà mắc cúm A (H5N1) Stt Triệu chứng lâm sàng Số con
quan sát Số con có biểu hiện Tỷ lệ (%) 1 Kém ăn 40 40 100
2 Bỏ ăn, uống nước nhiều 40 40 100
3 Ỉa chảy, phân loãng xanh trắng 40 40 100
4 Thở khó, há mồm thở dốc 40 33 82,50
5 Phù nề mắt, ựầu sưng to 40 30 75
6 Mào, tắch thâm tắm, phù nề 40 28 70
7 Chất nhầy chảy ra từ mũi mỏ 40 20 50
8 Xù lông 40 18 45
9 Sốt cao 40 18 45
10 đi lại không bình thường, rối lọan
vận ựộng ựộng 40 15 37,50
11 Lắc ựầu, vảy mỏ 40 15 37,50
12 Tụ huyết, xuất huyết dưới da chân 40 10 25
Kết quả bảng 4.2 cho thấy: bệnh thường diễn ra ở thể quá cấp tắnh và cấp tắnh. Triệu chứng lâm sàng của gà thay ựổi phụ thuộc vào chủng virus, lứa tuổi, trạng thái miễn dịch của gà, cũng như ựiều kiện quản lý chăm sóc. Các triệu chứng lâm sàng bao gồm: mào tắch phù nề thâm tắm, gà khó thở ho hen, chảy nước mũi, sốt cao, gà lười vận ựộng, rối loạn tiêu hóa ỉa chảy nặng, gà ựẻ sản
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 42 lượng trứng giảm rõ rệt, gà có triệu chứng thần kinh, một số bị xuất huyết, tụ huyết dưới da chân vùng không có lông.
Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy:
Gà kém ăn, bỏ ăn uống nước nhiều, phân loãng trắng xanh, mào và tắch thâm tắm, phù nề chiếm tỷ lệ 100%. Tỷ lệ gà có các triệu chứng này cao bởi vì khi gà ở trạng thái bệnh lý thì thường hay kém ăn dẫn ựến bỏ ăn, mặt khác ựây là một bệnh truyền nhiễm có căn bệnh gây ra với gà ở mọi ựộ tuổi và giống gà khác nhaụ Virus tấn công vào hệ tiêu hóa một cách nghiêm trọng gây ra gà bị ỉa chảy phân xanh trắng (100%). đây là những triệu chứng chung của nhiều bệnh truyền nhiễm khác nên rất khó trong chẩn ựoán phân biệt giữa bệnh cúm gia cầm và các bệnh khác như: Newcastle, bạch lỵ, CRD, Gumboro, Ẹ coliẦ
Gà có triệu chứng khó thở, há mồm thở dốc chiếm tỷ lệ khá cao 82,50%; Các bệnh như: CRD, viêm khắ quản truyền nhiễm, sổ mũi truyền nhiễm cũng cùng triệu chứng này nên cũng khó phân biệt trong chẩn ựoán bệnh (Lê Văn Năm, 2004).
Các triệu chứng như: sốt cao (45%), lắc ựầu vảy mỏ (37,50%), chất nhày chảy ra từ mũi, miệng (50%), gà có biểu hiện triệu chứng thần kinh, ựi lại không bình thường (37,50%) là những triệu chứng thường thấy ở bệnh cúm nhưng lại gần giống với bệnh Newcastle.
Triệu chứng ựầu mặt phù nề, sưng to (75%) không gặp trong bệnh
Newcastle nhưng lại khá giống với triệu chứng phổ biến của bệnh sổ mũi truyền nhiễm.
Gà có biểu hiện mào tắch thâm tắm, phù nề chiếm tỷ lệ tương ựối cao là 70%, ựây là một triệu chứng khá giống với triệu chứng của bệnh tụ huyết trùng, Newcastle mức ựộ nhẹ, CRD nên cũng ắt có giá trị trong chẩn ựoán phân biệt.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 43 Bên cạnh ựó, 45% gà mắc cúm có hiện tượng xù lông, ựây là triệu chứng ựể phân biệt với bệnh Newcastle vì trong bệnh Newcastle thì gà có hiện tượng lông xơ xác, sã cánh, cụp ựuôị Tuy nhiên tỷ lệ này trong bệnh cúm lại không cao nên không phải lúc nào cũng có trong chẩn ựoán bệnh, tỷ lệ còn lại là không xù lông, gà mắc ở thể quá cấp tắnh hoặc cấp tắnh rồi chết, lông vẫn mượt, chết nhanh lại rất giống với triệu chứng của bệnh tụ huyết trùng thể cấp tắnh.
Triệu chứng tụ huyết, xuất huyết da chân vùng không lông tuy thấp chỉ chiếm 25% nhưng là một triệu chứng không gặp trong bệnh nào khác của gia cầm. Triệu chứng này ắt gặp ở những ca bệnh ựã ựược tiêm phòng, gặp nhiều ở những ổ dịch không ựược tiêm phòng và có chủng virus cường ựộc do trong máu không có kháng thể phòng bệnh.
Như vậy ựây là một triệu chứng dùng ựể phân biệt rõ rệt giữa bệnh cúm gia cầm và các bệnh khác như: Newcastle, Gumboro, tụ huyết trùngẦ
Qua các triệu chứng trên ta thấy:
Các triệu chứng của bệnh cúm gia cầm dù ở tỷ lệ cao hay thấp cũng hay gặp trong các bệnh khác của gia cầm. Duy nhất chỉ có triệu chứng tụ huyết, xuất huyết ở da chân vùng không có lông là triệu chứng có giá trị trong chẩn ựoán phân biệt.
Khi gà mắc bệnh cúm, xuất hiện rất nhiều các triệu chứng như: ỉa chảy, bỏ ăn, mào tắch thâm tắm, rối loạn vận ựộngẦ cho thấy virus cúm gia cầm H5N1 tấn công vào rất nhiều hệ thống trong cơ thể gà: hệ hô hấp, tiêu hóa, thần kinhẦgây ra trạng thái bệnh lý rất phức tạp và rộng rãi làm cho các cơ quan trong cơ thể suy giảm hoặc mất chức năng sinh học trong cơ thể.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 44
Một số hình ảnh triệu chứng lâm sàng ở gà mắc cúm H5N1
Ảnh 4.1: Mào, tắch tắm tái, phù ựầu
Ảnh 4.3: Xuất huyết da chân vùng không lông
Ảnh 4.2: Gà xù lông
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 45
4.3. TỔN THƯƠNG đẠI THỂ TRÊN GÀ MẮC CÚM A - H5N1
Sau quá trình theo dõi quan sát ghi chép triệu chứng lâm sàng, chúng tôi ựã thực hiện mổ khám trên ựối tượng là gà mắc cúm ở thực ựịa (có kết quả xét nghiệm dương tắnh với cúm A H5N1 tại Trung tâm Chẩn ựoán Thú y Trung ương) ựể quan sát những biến ựổi ựại thể trên các cơ quan, tổ chức trong cơ thể gà bệnh. Qua kết quả mổ khám cho thấy các tổn thương ựại thể thường gặp ở gà mắc bệnh cúm cũng rất ựa dạng, phức tạp. Các tổn thương ựại thể biểu hiện ở nhiều mức ựộ khác nhau từ không rõ ràng cho tới rất ựặc trưng cho bệnh cúm gia cầm, từ ựó có ý nghĩa to lớn trong chẩn ựoán bệnh.
Các tổn thương ựại thể ở gà mắc bệnh cúm không phải lúc nào cũng giống nhau giữa các cá thể trong ựàn. Qua các mẫu mổ khám, tổn thương thường thấy ở các ca bệnh ựược thể hiện trong bảng 4.3 sau:
Bảng 4.3. Tổn thương ựại thể trên gà mắc cúm A (H5N1)
Stt Tổn thương ựại thể Số con
quan sát
Số con có tổn thương
Tỷ lệ (%)
1 Phổi viêm, xuất huyết 40 40 100
2 Ruột xuất huyết 40 40 100
3 Lách xuất huyết 40 38 95
4 Não sung huyết 40 35 87,50
5 Tuyến tụy xuất huyết, hoại tử 40 33 82,50
6 Dạ dày tuyến xuất huyết 40 32 80
7 Khắ quản xuất huyết, chứa dịch 40 32 80
8 Gan sưng, xuất huyết 40 30 75
9 Thận sưng, xuất huyết 40 30 75
10 Túi khắ ựục, viêm 40 30 75
11 Phù keo nhầy dưới da 40 28 70
12 Tim xuất huyết 40 25 62,50
13 Xuất huyết buồng trứng và ống dẫn
trứng ở gà ựẻ 20 12 60
14 Ổ nhớp xuất huyết 40 20 50
15 Túi Fabricius sưng 40 15 37,50
16 Xuất huyết cơ ựùi, ngực 40 13 32,50
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 46 Kết quả bảng 4.3 cho thấy các tổn thương: phổi viêm, xuất huyết; ruột xuất huyết là các bệnh tắch có tỷ lệ cao nhất chiếm 100% các ca bệnh nghiên cứụ Các tổn thương này góp phần giải thắch cho các triệu chứng như: ỉa chảy chiếm tới tỷ lệ 100%, thở khó ở mức cao là 82,50 % trong các ca bệnh quan sát ựược. Bên cạnh ựó các tổn thương này còn cho chúng ta biết ựược hệ hô hấp và hệ tiêu hóa là nơi mà virus tấn công và gây ra tác hại trầm trọng.
Tuy vậy, mặc dù có tỷ lệ cao ở các tổn thương này nhưng lại không giúp chẩn ựoán phân biệt giữa bệnh cúm gia cầm và các bệnh khác như: Newcastle, Ẹ coli, cầu trùng, CRD, tụ huyết trùng...bởi lẽ ở các bệnh này thì các tổn thương trên cũng thể hiện rất rõ.