- Dung dịch Lysis buffer Dung dịch K.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.2.1. Kết quả tách chiết DNA
Với sự phát triển vượt bậc của ngành Công nghệ Y sinh, hiện nay trên thế giới có nhiều kỹ thuật được áp dụng nhằm xác định tình trạng đột biến gen
K-RAS ở BN mắc UTĐTT. Một trong những bước đầu tiên của tất cả các kỹ
thuật đó là cách lấy bệnh phẩm để đưa vào làm xét nghiệm xác định tình trạng đột biến. Bệnh phẩm làm xét nghiệm có thể là mẫu máu hoặc mẫu mô của khối u. Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm của chúng tôi là mẫu bệnh phẩm mô phẫu thuật. Sau khi BN được phẫu thuật cắt bỏ khối u,
bệnh phẩm được bảo quản trong dung dịch formol 10% chuyển đến Khoa Giải phẫu bệnh lý, tại đây bệnh phẩm được xử lý đúc khuôn parafin và cắt lát nhuộm tiêu bản bằng phương pháp thường qui. Sau đó tiêu bản được các Bác sỹ chuyên khoa Giải phẫu bệnh lý đọc kết quả xác định là mô UTBMĐTT, chúng tôi tiến hành gửi khối mô được đúc trong parafin của những BN này để làm xét nghiệm xác định tình trạng đột biến gen K-RAS.
Tách chiết DNA là bước đầu tiên quan trọng của quy trình thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử. Tách chiết DNA tốt, các phân tử DNA không bị đứt gãy, không bị tạp nhiễm thì các phản ứng tiếp theo sẽ có độ chính xác cao. Có nhiều phương pháp tách chiết DNA, tuy nhiên phương pháp phenol/chlorroform được lựa chọn để tách chiết DNA trong nghiên cứu này. Đây là phương pháp tách chiết DNA cổ điển, cần nhiều thời gian hơn so với những phương pháp tách chiết DNA sử dụng các kit thường quy nhưng sản phẩm DNA thu được có nồng độ và độ tinh sạch cao.
Tất cả mẫu DNA được tách chiết từ mô UTBMĐTT đều có nồng độ và độ tinh sạch nằm trong khoảng 1,8 – 2,17 khi đo trên máy Nano-drop ở bước sóng 260/280 nm (Phụ lục 1). Như vậy, những mẫu DNA được tách chiết đều đảm bảo chất lượng, đủ điều kiện cho các bước xét nghiệm tiếp theo.
Hiện nay, trên thế giới có nhiều phương pháp khác nhau để xác định tình trạng đột biến gen K-RAS. Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen. Sau khi khuếch đại vùng codon 12, 13 của gen K-RAS bằng kỹ thuật nested PCR, sản phẩm PCR được tinh sạch từ agarose gel sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA). Sản phẩm PCR sau tinh sạch được đưa vào giải trình tự sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA). Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự của gen K-RAS hoang dại (wild type)
trên GenBank (National center for biotechnology information, NCBI)
Tất cả BN trong nhóm nghiên cứu đều được làm xét nghiệm đột biến gen K-RAS và đều có kết quả xác định tình trạng đột biến gen K-RAS. Tất cả những BN có đột biến gen K-RAS trong nghiên cứu này đều bị đột biến tại codon 12, chưa phát hiện BN nhân nào có đột biến tại codon 13.