- Dung dịch Lysis buffer Dung dịch K.
2.3.5.Nghiên cứu đột biến gen K-RAS
2.3.5.1. Lấy bệnh phẩm
Bệnh phẩm được lấy từ mô đúc trong block parafin.
2.3.5.2. Qui trình kỹ thuật xác định đột biến gen K-RAS
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen để xác định sự đột biến gen K-RAS ở BN bị UTBMĐTT.
Kỹ thuật tách chiết DNA:
Tách chiết DNA từ mẫu mô đúc parrafin của BN theo qui trình phenol/chloroform sau khi đã lựa chọn được chính xác vùng tế bào UT. Trước khi tách chiết bằng phenol/chloroform, parafin trong mô đúc được loại bỏ bằng xilen. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA được đo trên máy Nano-Drop, những mẫu DNA đạt giá trị OD 260/OD280 ≥ 1,8 được sử dụng để phân tích.
Quy trình khuếch đại phản ứng PCR của gen K-RAS:
Mẫu mô UTBMĐTT sau khi được khu trú vùng UT, được tiến hành tách chiết DNA theo phương pháp phenol – chloroform, sau đó được chuẩn về nồng độ 50 - 100ng/µl dùng làm khuôn cho phản ứng PCR.
Khuếch đại phản ứng PCR của gen K-RAS:
* Giai đoạn 1: Pha hỗn hợp cho phản ứng PCR:
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Khuôn DNA (50 – 100 ng/ µl) 1
3 dNTP 25 mM 1
4 Taq polymerase 0,1
5 Mồi xuôi (5 pmol/µl) 0,5
6 Mồi ngược (5 pmol/ µl) 0,5
7 Nước tinh khiết 5,9
Tổng thể tích 10
* Giai đoạn 2: Chạy PCR với chu trình nhiệt đã được tối ưu hóa: + 94oC : 5 phút + 94oC : 15 giây + 59oC : 30 giây x 37 chu kỳ + 72oC : 30 giây + 72oC : 5 phút + Giữ ở 4oC
* Giai đoạn 3: Điện di sản phẩm PCR:
- Chuẩn bị gel agarose 2% (đoạn gen kích thước 288bp):
+ Cho 15 ml TBE 1X (pha từ đệm TBE 10X ban đầu) + 0,3g agarose được hỗn hợp Z.
+ Đun hỗn hợp Z bằng lò vi sóng tới khi dung dịch trong suốt.
+ Đổ gel vào khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng (8 giếng). + Để 30 phút tới khi gel đông đặc hoàn toàn.
+ Bản gel điện di phải có độ dày khoảng 3 - 4 mm và được ngâm chìm hoàn toàn trong bể điện di đã đổ sẵn đệm TBE.
- Chuẩn bị mẫu điện di:
+ Nạp 5 µl sản phẩm khuếch đại PCR vào các giếng trên bản gel. + Nạp 5 µl thang DNA chuẩn (marker) loại 100bp.
- Chạy điện di:
Tiến hành điện di mẫu DNA bệnh cùng với thang DNA chuẩn trong 30 phút ở hiệu điện thế 90V.
- Nhuộm bản gel điện di:
+ Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm ethidium bromide trong 5 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Rửa bản gel bằng nước để loại bỏ phần ethyldium bromid dư.
- Chụp ảnh gel: Bản gel sau khi chạy điện di sẽ được chụp trên máy đọc trình tự gen 3100-Avant Genetic Analyzer (ABI - PRISM).
Sau mỗi chu kỳ, các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng để làm các phân tử DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Toàn bộ quy trình PCR thường gồm khoảng 25 - 40 chu kỳ. Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi.
Kỹ thuật giải trình tự gen:
Sau khi khuếch đại vùng codon 12, 13 của gen K-RAS bằng kỹ thuật nested PCR, sản phẩm PCR được tinh sạch từ agarose gel sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA). Sản phẩm PCR sau tinh sạch được đưa vào giải trình tự sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA). Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự của gen K-RAS hoang dại (wild type) trên GenBank (National center for biotechnology information, NCBI)