3. PHƯƠNG PHÁP, VẬT LIỆU VÀN ỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.5. Nghiên cứu khả năng kháng bệnh ựạo ôn của một số giống lúa
- Khả năng kháng bệnh của một số giống lúa có nguồn gốc ở Việt Nam
ựối với các chủng sinh lý nấm ựã ựược xác ựịnh tại Bắc Ninh.
- Khả năng kháng bệnh của một số giống lúa nhập nội từ Trung Quốc
ựối với các chủng sinh lý nấm ựã ựược xác ựịnh tại Bắc Ninh.
3.4.6. Khảo sát hiệu lực của một số loại thuốc phòng trừ bệnh
Phương pháp bố trắ thắ nghiệm: Các thắ nghiệm ựược bố trắ theo khối ngẫu nhiên ựầy ựủ (RCB)
+ Diện tắch ô thắ nghiệm: 30m2 + Số lần nhắc lại: 3 lần
+ Diện tắch ruộng thắ nghiệm: 480m2
+ Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh %, chỉ số bệnh %
+ Thời gian theo dõi: Trước khi xử lý thuốc, sau khi xử lý thuốc 7, 14, 21 ngày.
+ Lượng nước phun: 500-600l/ha
*Thắ nghiệm 1: Khảo sát hiệu lực một số thuốc trừ nấm ựối với bệnh ựạo ôn. CT1: Nativo750 WG - Liều lượng 120g/ha
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...30
CT3: Beam 75WP - Liều lượng 250g/ha CT4: đối chứng( Không phun)
*Thắ nghiệm 2: Khảo sát hiệu lực của nồng ựộ thuốc Nativo ựến bệnh CT1: Nativo 750WG 0,1%
CT2: Nativo 750WG 0,15% CT3: Nativo 750WG 0,2% CT4: đối chứng (Không phun)
*Thắ nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời ựiểm phun thuốc ựến bệnh ựạo ôn. CT1: Nativo 750WG 0,15% - Phun phòng khi bệnh chưa xuất hiện CT2: Nativo 750WG 0,15% - Phun khi bệnh chớm xuất hiện trên lá (TLB 1-5%)
CT3: Nativo 750WG 0,15%- Phun phòng ựạo ôn cổ bông (giai ựoạn lúa làm ựòng)
CT4: đối chứng (Không phun)
*Thắ nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của số lần phun thuốc ựối với bệnh ựạo ôn. CT1: Nativo 750WG : 1 lần khi chớm bệnh
CT2: Nativo 750WG: 2 lần (lần 1 khi chớm bệnh, lần 2 sau lần 1 là 7 ngày) CT3: Nativo 750WG: 2 lần (lần 1 khi chớm bệnh, lần 2 khi sắp trỗ) CT4: đối chứng (không phun)
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp nghiên cứu trong phòng
a. Phương pháp phân lập nấm
Mẫu bệnh ựược lấy từ ngoài ựồng ruộng về rửa sạch bằng nước máy sau
ựó rửa sạch bằng nước cất, ựặt mẫu trong hộp petri có giấy lọc ẩm, ựể hộp ở
nhiệt ựộ 26oC khoảng 2 - 3 ngày. Sau khi nấm mọc dùng ựầu que thủy tinh vô trùng quệt lên bề mặt vết bệnh ựể bào tử nấm dắnh vào ựầu que thủy tinh rồi trang ựầu que có bào tử nấm lên mặt ựĩa môi trường WA, ựưa lên kắnh hiển vi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...31
quan sát, dùng kim thủy tinh khêu bào tử, khêu chắnh xác một bào tử cấy vào
ựĩa môi trường PSA, mỗi ựĩa cấy 4 bào tử ở 4 góc sau ựó ựặt ựĩa vào tủ ựịnh ôn 26-280C. Sau 3-4 ngày bào tử phát triển thành tản nấm, dùng que cấy nấm lấy một mẩu thạch có sợi nấm non cấy vào ống nghiệm có môi trường PSA nghiêng ựể giữ nguồn dùng nghiên cứu.
b. Nghiên cứu khả năng phát triển của nấm Pyricularia oryzae Cav. trên các môi trường nhân tạo
* Chuẩn bị môi trường nghiên cứu Gồm 5 loại môi trường:
+ PSA: Khoai tây 200g + đường saccaroza 20g + agar 20g + 1000ml nước cất + 0,1% kháng sinh Neomcin
+ PGA: Khoai tây 200g + đường gluco 20g + agar 20g + 1000ml nước cất + 0,1% kháng sinh Neomcin
+ OMA: Bột lúa mạch 50g + đường saccaroza 20g + agar 25g + 1000ml nước cất + 0,1% kháng sinh Neomcin
+ Môi trường cám agar: Cám 20g + đường saccaroza 20g + agar 20g + 1000ml nước cất + 0,1% kháng sinh Neomcin
+ Môi trường bột gạo agar: Bột gạo 60g + đường saccaroza 20g + agar 25g + 1000ml nước cất + 0,1% kháng sinh Neomcin
* Chuẩn bị nguồn nấm
Cấy nấm từống nghiệm (ống nguồn) vào ựĩa Petri môi trường PSA, (cấy 1 ựiểm ở chắnh giữa ựĩa) sau 4 - 6 ngày và dùng ựó làm ựĩa nguồn cấy nấm. * Cấy nấm
đối với thắ nghiệm nghiên cứu khả năng phát triển của một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav.trên một số môi trường:
Từ nguồn nấm Pyricularia oryzae Cav. thuần ựã mọc ở trên ựĩa PSA, dùng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...32
Dùng que cấy nấm lấy từng khoanh cấy trên 4 loại môi trường ựã chuẩn bị, mỗi
ựĩa cấy ở khoanh chắnh giữa, mỗi loại môi trường, mỗi chủng phân lập cấy 3 ựĩa. * Các chỉ tiêu theo dõi
- đo ựường kắnh của tản nấm sau khi cấy nấm 2, 4, 6, 8, 10 ngày. đo gián tiếp ở phắa ngoài của hộp, không mở nắp hộp, mỗi ựĩa ựo 2 lần theo hình dấu (+).
- Xác ựịnh số lượng bào tửựược hình thành: sau khi cấy 14 ngày, rửa sợi nấm, ựặt ựĩa nấm trong tủ 12 giờ sáng, 12 giờ tối trong 3 ngày ựể nấm sinh bào tử. Dùng 20ml Tween 20 với nồng ựộ 1/10.000 ựể rửa và lọc lấy bào tử
cho vào một hộp Petri, lấy một giọt dung dịch bào tử lên buồng ựếm ựậy lamen lại ựưa lên kắnh hiển vi, ựếm bào tử của 16 ô, sau ựó tắnh số bào tử/ml.
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu trong nhà lưới
a. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
* Chuẩn bị
Gieo hạt của các giống lúa cần nghiên cứu vào các khay nhôm có chứa bùn. Mỗi khay gieo 4 giống, mỗi giống 2 hàng, mỗi hàng 10 hạt.
Sau khi gieo ựược 20 Ờ 22 ngày thì phun dung dịch bào tửựể lây nhiễm. * Chuẩn bị nguồn bào tửựể lây nhiễm
Nguồn nấm ựược lấy từ ống PSA nghiêng cấy vào ựĩa môi trường cám agar, mỗi mẫu phân lập cấy 2 ựĩa, mỗi ựĩa cấy 3 ựiểm, sau ựó ựặt ựĩa ựã cấy vào tủ ựịnh ôn 26 Ờ 280C trong 2 tuần. Trong thời gian ựó sợi nấm sẽ mọc kắn môi trường. Lấy ựĩa môi trường ra khỏi tủ, dùng bình tia phun nước cất không ion vào và dùng chổi lông quét ựi quét lại nhiều lần trên mặt ựĩa, rồi lại dùng bình tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước, nghiêng ựĩa quét khô mặt thạch (Mỗi mẫu phân lập rửa bằng một chổi, rửa xong luộc chổi trong nước sôi). Các ựĩa rửa xong ựược ựặt trong tủ 12 giờ sáng, 12 giờ tối sau 3 ngày, bào tửựã hình thành. Dùng nước cất vô trùng có pha Tween 20 với nồng ựộ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...33
* Lây nhiễm
Dùng bình phun cầm tay loại có thể tắch 0,5l ựể phun dung dịch bào tử
lên các khay lúa. Phun ướt ựều khắp lá lúa rồi ựặt các khay ựã ựược lây nhiễm vào trong tủ lây nhiễm. Phun mù giữ ẩm liên tục trong 24h (ẩm ựộ > 90%). Sau khoảng thời gian ựó, ựem lúa ựã lây nhiễm ra ngoài nhà lưới ựặt dưới ánh sáng tán xạ, tưới ựầy ựủ cho lúa ựể lúa vẫn tiếp tục phát triển bình thường.
* đánh giá
Sau 7 ngày lây nhiễm tiến hành ựánh giá phản ứng của các giống lúa theo thang phân cấp của Kato,1993
+ Cấp 0: Không có vết bệnh, kháng cao(HR)
+ Cấp 1: Vết bệnh là chấm nhỏ bằng ựầu kim, kháng (R) + Cấp 2: Vết bệnh to hơn màu nâu nhạt ựến nâu tối, kháng (R) + Cấp 3: Vết bệnh to hơn có màu xám ở giữa vết bệnh, nhiễm (S)
+ Cấp 4: Vết bệnh ựiển hình (Hình thoi màu xám ở giữa), nhiễm nặng (HS) Cấp 0,1,2: Kháng bệnh Cấp 3,4: Nhiễm bệnh
b. Phương pháp xác ựịnh chủng sinh lý (race) của các mẫu phân lập nấmPyricularia oryzae Cav.
đánh giá phản ứng bệnh ựạo ôn của một số giống lúa chỉ thị Nhật Bản với các mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav. Bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo, mỗi giống lúa này ựều có gen kháng ựạo ôn khác nhau ựã ựược xác ựịnh và ựược mã hóa bằng các chữ số.
Từ kết quả phản ứng trên: Dựa trên mã số của các giống và phản ứng kháng nhiễm bệnh của chúng ựể xác ựịnh các chủng sinh lý (race) nấm
Pyricularia oryzae Cav. Bằng cách cộng tất cả các mã số của các giống lúa có khả năng nhiễm bệnh (vết bệnh cấp 3, 4) lại với nhau theo thứ tự hàng thập phân, hàng ựơn vị, hàng chục, hàng trăm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...34
3.5.3. Phương pháp ựiều tra ngoài ựồng ruộng (Theo phương pháp ựiều tra phát hiện sâu bệnh hại cây trồng của cục BVTV 1995). phát hiện sâu bệnh hại cây trồng của cục BVTV 1995).
* điều tra tình hình của bệnh
- Ruộng ựiều tra: Trên mỗi giống, mỗi trà lúa, mỗi chân ựất, mỗi vùng sản xuất khác nhau: lấy 3 ruộng ựại diện.
- điểm ựiều tra: Mỗi ruộng ựiều tra theo 5 ựiểm chéo góc, mỗi ựiểm ựiều tra 10 khóm, mỗi khóm ựiều tra 1 dảnh, cây ựiều tra ựầu tiên cách bờ ắt nhất 2m.
- Chỉ tiêu ựiều tra: điều tra số lá, bông bị bệnh và phân cấp lá, bông bị
bệnh ựể tắnh tỷ lệ và chỉ số bệnh.
- Thời gian ựiều tra: Giai ựoạn lúa ựẻ nhánh, ựứng cái, làm ựòng, trước trỗ, sau trỗ 20 ngày.
điều tra diễn biến của bệnh ựại diện cho 2 vùng sản xuất. - Chọn vùng
Vùng 1: chọn xã Ninh Xá- Thuận Thành- Bắc Ninh.(Vùng chân ựất vàn, trồng lúa có luân canh rau).
Vùng 2: Chọn xã đại đồng Thành- Thuận Thành- Bắc Ninh.(Vùng ựất trũng, thuần lúa)
- Ruộng ựiều tra: Trên mỗi giống ựại diện cho 1 vùng lấy 3 ruộng ựại diện. - điểm ựiều tra: Mỗi ruộng ựiều tra theo 5 ựiểm chéo góc, mỗi ựiểm ựiều tra 10 khóm, mỗi khóm ựiều tra 1 dảnh, cây ựiều tra ựầu tiên cách bờ ắt nhất 2m.
- Chỉ tiêu ựiều tra: điều tra số lá, bông bị bệnh và phân cấp lá, bông bị
bệnh ựể tắnh tỷ lệ và chỉ số bệnh.
- Thời gian ựiều tra: điều tra vào các giai ựoạn lúa ựẻ nhánh, ựứng cái, làm ựòng, trước trỗ, sau trỗ 20 ngày.
* Cấp bệnh trên lá ựược ựánh giá theo thang 9 cấp + Cấp 0: Không có vết bệnh trên lá
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...35
+ Cấp 1: Các vết bệnh màu nâu, nhỏ như mũi kim, không có vùng sinh bào tử.
+ Cấp 2: Các vết bệnh nhỏ tròn hoặc hình thon dài, ựường kắnh 1-2mm có viền nâu rõ rệt, hầu hết các lá dưới ựều có vết bệnh.
+ Cấp 3: Vết bệnh tương tự như cấp 2, nhưng các lá phắa trên cũng bị bệnh. + Cấp 4: Vết bệnh có dạng hình thoi ựiển hình, dài từ 3mm trở lên, diện tắch vết bệnh trên lá < 4%. + Cấp 5: Vết bệnh ựiển hình, các vết bệnh có thể liên kết với nhau, diện tắch vết bệnh trên lá 4 - 10%. + Cấp 6: Diện tắch vết bệnh trên lá > 10-25%. + Cấp 7: diện tắch vết bệnh trên lá > 25-50%. + Cấp 8: diện tắch vết bệnh trên lá > 50-75%. + Cấp 9: diện tắch vết bệnh trên lá > 75%. * Phân cấp bệnh trên bông
+ Cấp 0: Không có vết bệnh trên bông.
+ Cấp 1: Vết bệnh có trên 1 vài sợi gié sơ cấp hoặc nhánh thứ cấp. + Cấp 3: Vết bệnh có trên 1 vài sợi gié sơ cấp hoặc phần giữa của trục bông. + Cấp 5: Vết bệnh bao quanh một phần cuống bông hoặc phần ống rạ
phắa dưới của trục bông.
+ Cấp 7: Vết bệnh bao quanh toàn bộ cổ bông hoặc phần trục bông gần cổ bông, trên bông có 30% số hạt chắc trở lên.
+ Cấp 9: toàn bộ cổ bông bị bệnh, có số hạt chắc < 30%.
** Công thức tắnh toán số liệu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...36 * Chỉ số bệnh a: Số lá (dảnh) bị bệnh ở mỗi cấp. b: Trị số cấp bệnh tương ứng. N: Số lá (dảnh) ựiều tra. T: Trị số cấp bệnh cao nhất.
* Công thức tắnh hiệu lực của thuốc trong phòng: Theo công thức Abbot
C: đường kắnh tản nấm ở công thức ựối chứng. T: đường kắnh tản nấm ở công thức xử lý thuốc.
* Công thức tắnh hiệu lực của thuốc ngoài ựồng Theo công thức Henderson Ờ Tilton
Tb: Chỉ số bệnh ở các công thức thắ nghiệm trước khi phun. Ta: Chỉ số bệnh ở các công thức thắ nghiệm sau khi phun. Cb: Chỉ số bệnh ở các công thức ựối chứng trước khi phun. Ca: Chỉ số bệnh ở các công thức ựối chứng sau khi phun.
** Xử lý số liệu: Bằng phần mềm EXEL và chương trình IRRISTAT 4.03
∑(a x b) N x T x 100 Chỉ số bệnh(%) = Tổng số lá (dảnh) bị bệnh Tống số lá (dảnh) ựiều tra x 100 Tỷ lệ bệnh (%) = C - T C x 100 Hiệu lực thuốc (%) = Ta x Cb Tb x Ca ( 1- ) x 100 Hiệu lực thuốc (%) =
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...37
4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Tình hình bệnh ựạo ôn ở vụ xuân trong một số năm qua của tỉnh Bắc Ninh
Bắc Ninh là một trong những tỉnh ựồng bằng của vùng ựồng bằng sông Hồng với diện tắch trồng lúa là 39510 ha, cây lúa vẫn là cây trồng chắnh trong cơ cấu cây trồng của tỉnh. Trong những năm gần ựây do quá trình công nghiệp hóa cho nên diện tắch cây trồng nói chung trong ựó có diện tắch cây lúa nói riêng ựang ngày càng thu hẹp lại. đã có những sự thay ựổi ựáng kể trong phương thức sản xuất lúa nhưựưa giống mới vào sản xuất, chuyển giao khoa học kỹ thuật tới từng hộ nông dân nhưng cũng chắnh vì thế mà ựã dẫn tới mức
ựộ phát sinh phát triển của dịch hại trên cây lúa diễn ra hết sức phức tạp. Một trong những dịch hại ựiển hình là bệnh ựạo ôn. Trong một số năm gần ựây diện tắch bị nhiễm ựạo ôn của tỉnh chiếm một tỷ lệ không nhỏ. Kết quả thống kê ựược ghi ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tình hình bệnh ựạo ôn hại lúa trong vụ xuân từ năm 2007- 2009 của tỉnh Bắc Ninh 2007 2008 2009 Bộ phận bị hại DT nhiễm (ha) DT Nhiễm nặng (ha) DT Lụi (ha) DT nhiễm (ha) DT Nhiễm nặng (ha) DT Lụi (ha) DT nhiễm (ha) DT Nhiễm nặng (ha) DT Lụi (ha) đạo ôn lá 645 37,5 0,0 766 18,5 0,0 1690 101,8 5,7 đạo ôn cổ bông 131 5,7 2,1 31,5 1,8 0,0 262 12,5 5,0 (Nguồn: chi cục BVTV tỉnh Bắc Ninh) Ghi chú DT: diện tắch bị nhiễm bệnh ựạo ôn
Qua bảng số liệu cho thấy mức ựộ nhiễm ựạo ôn của tỉnh tăng lên trong một số năm gần ựây. đối với ựạo ôn lá vụ xuân năm 2009 là cao nhất 1690 ha, lớn gấp 2 lần so với vụ xuân năm 2008. Diện tắch nhiễm nặng cũng tăng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...38
lên ựáng kể, vụ xuân năm 2007 chỉ có 37,5 ha, ựến vụ xuân năm 2008 giảm xuống còn 18,5 ha nhưng ựến vụ xuân năm 2009 tăng lên 101,8 ha gấp 5,5 lần so với vụ xuân năm 2008. Diện tắch bị lụi vụ xuân năm 2007 và 2008 là 0 ha nhưng sang vụ xuân năm 2009 diện tắch bị lụi là 5,7 ha.
đối với ựạo ôn cổ bông diện tắch nhiễm ựạo ôn cổ bông vụ xuân 2009 cũng chiếm tỷ lệ cao nhất 262 ha, gấp 2 lần so với vụ xuân năm 2007 và gấp 8,3 lần so với vụ xuân năm 2008. Diện tắch bị lụi cũng tăng lên ựáng kể, vụ
xuân 2007 chỉ có 2,1 ha ựến vụ xuân 2008 là 0 ha, nhưng ựến vụ xuân 2009 là 5,0 ha. điều này ựược lý giải là do vụ xuân 2009 ựiều kiện khắ hậu thời tiết rất thuận lợi cho bệnh ựạo ôn phát sinh và gây hại trên diện rộng
Trong những năm khác nhau thì mức ựộ gây hại của bệnh ựạo ôn ở các năm cũng khác nhau, ựược thể hiện rỗ nhất trên các giống nhiễm bệnh ựạo ôn nặng ở giai ựoạn cây lúa bị nhiễm bệnh nặng nhất. Song song với việc thống kê tình hình bệnh ựạo ôn trong một số năm qua của tỉnh Bắc Ninh chúng tôi cũng tiến hành thống kê mức ựộ bệnh ựạo ôn trên một số giống nhiễm từ vụ
xuân 2007-2010. Kết quả thống kê ựược trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Mức ựộ bệnh ựạo ôn trên một số giống lúa trong vụ xuân ở một