3. PHƯƠNG PHÁP, VẬT LIỆU VÀN ỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu trong nhà lưới
a. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
* Chuẩn bị
Gieo hạt của các giống lúa cần nghiên cứu vào các khay nhôm có chứa bùn. Mỗi khay gieo 4 giống, mỗi giống 2 hàng, mỗi hàng 10 hạt.
Sau khi gieo ựược 20 Ờ 22 ngày thì phun dung dịch bào tửựể lây nhiễm. * Chuẩn bị nguồn bào tửựể lây nhiễm
Nguồn nấm ựược lấy từ ống PSA nghiêng cấy vào ựĩa môi trường cám agar, mỗi mẫu phân lập cấy 2 ựĩa, mỗi ựĩa cấy 3 ựiểm, sau ựó ựặt ựĩa ựã cấy vào tủ ựịnh ôn 26 Ờ 280C trong 2 tuần. Trong thời gian ựó sợi nấm sẽ mọc kắn môi trường. Lấy ựĩa môi trường ra khỏi tủ, dùng bình tia phun nước cất không ion vào và dùng chổi lông quét ựi quét lại nhiều lần trên mặt ựĩa, rồi lại dùng bình tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước, nghiêng ựĩa quét khô mặt thạch (Mỗi mẫu phân lập rửa bằng một chổi, rửa xong luộc chổi trong nước sôi). Các ựĩa rửa xong ựược ựặt trong tủ 12 giờ sáng, 12 giờ tối sau 3 ngày, bào tửựã hình thành. Dùng nước cất vô trùng có pha Tween 20 với nồng ựộ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...33
* Lây nhiễm
Dùng bình phun cầm tay loại có thể tắch 0,5l ựể phun dung dịch bào tử
lên các khay lúa. Phun ướt ựều khắp lá lúa rồi ựặt các khay ựã ựược lây nhiễm vào trong tủ lây nhiễm. Phun mù giữ ẩm liên tục trong 24h (ẩm ựộ > 90%). Sau khoảng thời gian ựó, ựem lúa ựã lây nhiễm ra ngoài nhà lưới ựặt dưới ánh sáng tán xạ, tưới ựầy ựủ cho lúa ựể lúa vẫn tiếp tục phát triển bình thường.
* đánh giá
Sau 7 ngày lây nhiễm tiến hành ựánh giá phản ứng của các giống lúa theo thang phân cấp của Kato,1993
+ Cấp 0: Không có vết bệnh, kháng cao(HR)
+ Cấp 1: Vết bệnh là chấm nhỏ bằng ựầu kim, kháng (R) + Cấp 2: Vết bệnh to hơn màu nâu nhạt ựến nâu tối, kháng (R) + Cấp 3: Vết bệnh to hơn có màu xám ở giữa vết bệnh, nhiễm (S)
+ Cấp 4: Vết bệnh ựiển hình (Hình thoi màu xám ở giữa), nhiễm nặng (HS) Cấp 0,1,2: Kháng bệnh Cấp 3,4: Nhiễm bệnh
b. Phương pháp xác ựịnh chủng sinh lý (race) của các mẫu phân lập nấmPyricularia oryzae Cav.
đánh giá phản ứng bệnh ựạo ôn của một số giống lúa chỉ thị Nhật Bản với các mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav. Bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo, mỗi giống lúa này ựều có gen kháng ựạo ôn khác nhau ựã ựược xác ựịnh và ựược mã hóa bằng các chữ số.
Từ kết quả phản ứng trên: Dựa trên mã số của các giống và phản ứng kháng nhiễm bệnh của chúng ựể xác ựịnh các chủng sinh lý (race) nấm
Pyricularia oryzae Cav. Bằng cách cộng tất cả các mã số của các giống lúa có khả năng nhiễm bệnh (vết bệnh cấp 3, 4) lại với nhau theo thứ tự hàng thập phân, hàng ựơn vị, hàng chục, hàng trăm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...34
3.5.3. Phương pháp ựiều tra ngoài ựồng ruộng (Theo phương pháp ựiều tra phát hiện sâu bệnh hại cây trồng của cục BVTV 1995).