3. PHƯƠNG PHÁP, VẬT LIỆU VÀN ỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp nghiên cứu trong phòng
a. Phương pháp phân lập nấm
Mẫu bệnh ựược lấy từ ngoài ựồng ruộng về rửa sạch bằng nước máy sau
ựó rửa sạch bằng nước cất, ựặt mẫu trong hộp petri có giấy lọc ẩm, ựể hộp ở
nhiệt ựộ 26oC khoảng 2 - 3 ngày. Sau khi nấm mọc dùng ựầu que thủy tinh vô trùng quệt lên bề mặt vết bệnh ựể bào tử nấm dắnh vào ựầu que thủy tinh rồi trang ựầu que có bào tử nấm lên mặt ựĩa môi trường WA, ựưa lên kắnh hiển vi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...31
quan sát, dùng kim thủy tinh khêu bào tử, khêu chắnh xác một bào tử cấy vào
ựĩa môi trường PSA, mỗi ựĩa cấy 4 bào tử ở 4 góc sau ựó ựặt ựĩa vào tủ ựịnh ôn 26-280C. Sau 3-4 ngày bào tử phát triển thành tản nấm, dùng que cấy nấm lấy một mẩu thạch có sợi nấm non cấy vào ống nghiệm có môi trường PSA nghiêng ựể giữ nguồn dùng nghiên cứu.
b. Nghiên cứu khả năng phát triển của nấm Pyricularia oryzae Cav. trên các môi trường nhân tạo
* Chuẩn bị môi trường nghiên cứu Gồm 5 loại môi trường:
+ PSA: Khoai tây 200g + đường saccaroza 20g + agar 20g + 1000ml nước cất + 0,1% kháng sinh Neomcin
+ PGA: Khoai tây 200g + đường gluco 20g + agar 20g + 1000ml nước cất + 0,1% kháng sinh Neomcin
+ OMA: Bột lúa mạch 50g + đường saccaroza 20g + agar 25g + 1000ml nước cất + 0,1% kháng sinh Neomcin
+ Môi trường cám agar: Cám 20g + đường saccaroza 20g + agar 20g + 1000ml nước cất + 0,1% kháng sinh Neomcin
+ Môi trường bột gạo agar: Bột gạo 60g + đường saccaroza 20g + agar 25g + 1000ml nước cất + 0,1% kháng sinh Neomcin
* Chuẩn bị nguồn nấm
Cấy nấm từống nghiệm (ống nguồn) vào ựĩa Petri môi trường PSA, (cấy 1 ựiểm ở chắnh giữa ựĩa) sau 4 - 6 ngày và dùng ựó làm ựĩa nguồn cấy nấm. * Cấy nấm
đối với thắ nghiệm nghiên cứu khả năng phát triển của một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav.trên một số môi trường:
Từ nguồn nấm Pyricularia oryzae Cav. thuần ựã mọc ở trên ựĩa PSA, dùng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...32
Dùng que cấy nấm lấy từng khoanh cấy trên 4 loại môi trường ựã chuẩn bị, mỗi
ựĩa cấy ở khoanh chắnh giữa, mỗi loại môi trường, mỗi chủng phân lập cấy 3 ựĩa. * Các chỉ tiêu theo dõi
- đo ựường kắnh của tản nấm sau khi cấy nấm 2, 4, 6, 8, 10 ngày. đo gián tiếp ở phắa ngoài của hộp, không mở nắp hộp, mỗi ựĩa ựo 2 lần theo hình dấu (+).
- Xác ựịnh số lượng bào tửựược hình thành: sau khi cấy 14 ngày, rửa sợi nấm, ựặt ựĩa nấm trong tủ 12 giờ sáng, 12 giờ tối trong 3 ngày ựể nấm sinh bào tử. Dùng 20ml Tween 20 với nồng ựộ 1/10.000 ựể rửa và lọc lấy bào tử
cho vào một hộp Petri, lấy một giọt dung dịch bào tử lên buồng ựếm ựậy lamen lại ựưa lên kắnh hiển vi, ựếm bào tử của 16 ô, sau ựó tắnh số bào tử/ml.