3.1. Đối tượng nghiờn cứu
Đối tượng nghiờn cứu là lợn con theo mẹỉa phõn trắng ở trại lợn Thành Đồng - Mờ Linh – Hà Nội.
Lợn thớ nghiệm được chia làm 3 nhúm tuổi khỏc nhau: + Nhúm 1: Lợn con từ sơ sinh đến 7 ngày tuổi.
+ Nhúm 2: Lợn con từ 8 đến 14 ngày tuổi. + Nhúm 3: Lợn con từ 15 đến 21 ngày tuổi.
Lợn thớ nghiệm đều được chọn từ những lợn mẹ đó được tiờm cỏc loại vacxin phũng bệnh do virus gõy ra theo quy trỡnh chuẩn.
3.2. Nguyờn liệu
* Mụi trường nuụi cấy
Cỏc mụi trường phổ thụng tự chế biến trong phũng thớ nghiệm để nuụi cấy mẫu nghiờn cứu bao gồm: nước thịt, thạch thường...
Cỏc mụi trường chuyờn dụng để phõn lập và giỏm định vi khuẩn do hóng Oxoid của Anh sản xuất: Macconkey Agar, Brilliant Green Agar (BGA), Chapman Agar, Edwards Medium, thạch mỏu, thạch khỏng sinh.
* Giấy tẩm khỏng sinh:
Giấy tẩm khỏng sinh do Oxoid sản xuất bao gồm cỏc loại: Norfloxacin, Tetracyclin, Kanamycin, Enrofloxacin, Colistin, Neomycin, Penicillin, Amoxicillin/Clavulanic acid (AMC), Sulfamethoxazol – Trimethoprim (SXT), Gentamycin.
* Thuốc khỏng sinh
Sử dụng 4 loại khỏng sinh: Amoxycillin, Colistin, Gentamycin và Enrofloxacin.
Chỳng tụi sử dụng 4 loại khỏng sinh này để điều trị bệnh lợn con phõn trắng tại trại Thành Đồng dưới dạng cỏc chế phẩm: Amox 10%, Belcomycin S, Genta – Dox và Enrovet 10%.
* Dụng cụ thớ nghiệm:
- Dụng cụ trong phũng thớ nghiệm: đĩa lồng, ống thớ nghiệm, kớnh hiển vi, tủ sấy, tủ hấp ướt,...
- Cỏc dung dịch và thuốc nhuộm: cồn đỏ fucxin, tớm gentian, lugol, cồn axeton,...
3.3. Nội dung thớ nghiệm
3.3.1. Xỏc định sự biến động của một số vi khuẩn hiếu khớ thường gặp trong phõn lợn con theo mẹ khoẻ mạnh bỡnh thường và khi bịỉa phõn trắng.
3.3.2. Kiểm tra tớnh mẫn cảm của E.coli, Salmonella phõn lập từ phõn lợn con theo mẹ bịỉa phõn trắng với cỏc thuốc khỏng sinh và hoỏ học trị liệu thường dựng trong điều trị.
3.3.3. Kiểm tra tớnh khỏng thuốc của E.coli, Salmonella phõn lập từ phõn lợn con theo mẹ bịỉa phõn trắng với cỏc thuốc khỏng sinh và hoỏ học trị liệu thường dựng trong điều trị.
3.3.4. Xỏc định hiệu quả điều trị của một số thuốc sau khi làm khỏng sinh đồ trong điều trị bệnh lợn con phõn trắng.
3.4. Phương phỏp nghiờn cứu
3.4.1. Phương phỏp lấy mẫu
* Phương phỏp lấy mẫu:
Tất cả cỏc mẫu phõn được lấy ngay tại hậu mụn hoặc ngay sau khi lợn mới thải ra. Mẫu phõn lấy được chứa trong syringe vụ trựng (trường hợp mẫu phõn loóng chứa nhiều nước) hoặc bằng lọ thuỷ tinh vụ trựng cú nỳt bụng (trường hợp mẫu phõn bỡnh thường).
Mẫu lấy về nếu chưa kịp xử lớ ngay sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 40C.
3.4.2. Phương phỏp xỏc định số loại và số lượng vi khuẩn trong phõn lợn
* Phương phỏp nuụi cấy vi khuẩn:
Cõn 1 gram phõn cho vào ống nghiệm vụ trựng nghiền nỏt với 9 ml nước sinh lớ ta được độ pha loóng 10-1, dựng syringe vụ trựng trộn đều nhiều lần. Sau đú hỳt 1ml dung dịch này sang ống thứ 2 đựng 9ml nước sinh lớ vụ trựng, trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến nồng độ pha loóng thớch hợp để nuụi cấy.
* Cỏch nuụi cấy: dựng syringe vụ trựng hỳt 0,1 ml dịch pha loóng ở cỏc nồng độ đó chọn vào 1 đĩa mụi trường. Mỗi nồng độ ở mỗi mụi trường cấy trờn ba đĩa lồng. Cấy bằng phương phỏp lỏng đều dịch pha loóng trờn bề mặt thạch. Sau đú để cỏc đĩa thạch vào tủấm 370C/24 giờ.
* Xỏc định số lượng vi khuẩn
Chỳng tụi sử dụng phương phỏp Koch: cấy vi khuẩn trong mụi trường thạch cứng rồi đếm số lượng khuẩn lạc (CFU). Số lượng CFU tương đương với số lượng vi khuẩn.
* Tớnh kết quả
Cấy 0,1 ml mẫu pha loóng trờn một đĩa petri, sau nuụi cấy 370C/24 giờ đếm số khuẩn lạc rồi tớnh kết quả theo cụng thức sau:
Số lượng vi khuẩn cú trong 1gram phõn là: X = 10.a.b
Trong đú: X: số vi khuẩn trong 1gram phõn
a: số lượng CFU trung bỡnh trờn 1 đĩa petri b: nồng độ pha loóng
* Xỏc định số loại vi khuẩn thường gặp trong phõn lợn
Mỗi loại vi khuẩn khi mọc trờn mụi trường thạch thường cú đặc tớnh mọc khỏc nhau. Trờn cơ sở đú cú thể phõn loại và xỏc định được số lượng của từng loại. Thụng qua việc phõn loại CFU qua hỡnh thỏi, kớch thước, màu sắc,
dạng khuẩn lạc (S, M, R), đếm số lượng từng loại. Sau đú tiến hành phõn lập giỏm định cỏc khuẩn lạc đú bằng cỏch chọn cỏc khuẩn lạc điển hỡnh cho từng loại vi khuẩn cấy sang cỏc mụi trường chuyờn dụng.
3.4.3. Kiểm tra tớnh mẫn cảm, tớnh khỏng thuốc của E.coli, Salmonella phõn lập từ phõn lợn con ỉa phõn trắng với một số thuốc khỏng sinh và phõn lập từ phõn lợn con ỉa phõn trắng với một số thuốc khỏng sinh và thuốc hoỏ học trị liệu bằng phương phỏp làm khỏng sinh đồ
Cỏc loại giấy tẩm khỏng sinh được sử dụng làm khỏng sinh đồ theo phương phỏp khuếch tỏn trờn thạch Antibiotic Agar (Oxoid) dựa theo nguyờn lớ của Kirby – Bauer (Bauer,1966).
Vi khuẩn gõy bệnh sau khi phõn lập thuần khiết, được nuụi ở nước thịt 370C/24 giờ. Chuẩn bị mụi trường, giấy tẩm khỏng sinh: giấy tẩm khỏng sinh được bảo quản ở 90C. Trước khi sử dụng, lấy giấy ra ngoài cho cõn bằng với nhiệt độ phũng.
Cỏch làm: dàn đều vi khuẩn trờn mặt thạch bằng đỏy ống nghiệm vụ trựng. Đợi 3-5 phỳt (khụng quỏ 15 phỳt) cho rỏo mặt thạch. Đặt cỏc khoanh giấy khỏng sinh lờn bề mặt thạch bằng một pink kẹp vụ trựng. Khụng dịch chuyển khoanh giấy khi nú đó tiếp xỳc với mặt thạch. Dựng đầu pink ấn nhẹ khoanh giấy để đảm bảo khoanh giấy tiếp xỳc hoàn toàn với mặt thạch. Cỏc khoanh giấy đặt cỏch nhau ớt nhất 24 mm tương đương 6 khoanh trờn 1 đĩa đường kớnh 90 mm. Đợi khoảng 15 phỳt, đặt vào tủấm 370C/16 – 18 giờ.
Đọc kết quả:
Sau khi nuụi cấy ở tủ ấm 370C/16 – 18 giờ, đo đường kớnh vũng vụ khuẩn bằng thước mm. Nếu cạnh của vũng ức chế khụng rừ nột thỡ phải đọc đường kớnh lớn nhất, nhỏ nhất rồi cộng chia trung bỡnh. Đường kớnh của vũng vụ khuẩn được tớnh ra mm và được đỏnh giỏ: mẫn cảm cao (H), mẫn cảm trung bỡnh (I), hay khỏng (R). Nếu khuẩn lạc mọc trong vũng ức chế rừ ràng thỡ phải nuụi cấy, phõn lập và thử lại.
Bảng đỏnh giỏ đường kớnh vũng vụ khuẩn chuẩn STT Loại khỏng sinh Ký hiệu Lượng khỏng sinh (àg) R (≤) (mm) I (mm) H (≥) (mm) 1 Norfloxacin Nor 10 12 13 - 16 17 2 Gentamycin GM 10 12 13 - 14 15 3 Tetracyclin TE 30 14 15 -18 19 4 Kanamycin K 30 13 14 - 17 18 5 Sulfamethoxazole/ Trimethoprime SXT 23,35/1,25 10 11 -15 16 6 Enrofloxacin EnR 20 17 18 - 20 21 7 Amoxicillin/
Clavulanic acid AMC 30 14 15 - 16 17
8 Colistin CL 50 14 15 -17 18
9 Neomycin N 30 12 13 -16 17
10 Penicillin∗ PG 10UI 11 12-21 22
Bảng ý nghĩa vũng vụ khuẩn. Nguồn: Oxoid từ NCCLS (1990) M2A4 (Oxiod, 1982) [60].
Ghi chỳ: Penicillin∗: đối chứng (-) để kiểm tra lại kết quả phõn lập. H (High): mẫn cảm cao.
I (Intermediate): mẫn cảm trung bỡnh. R (Resistance): khỏng.
3.5. Xử lớ số liệu
Toàn bộ số liệu được xử lớ theo phương phỏp thống kờ sinh vật học bằng chương trỡnh phần mềm tớnh Excel 2000.