3. Nội dung, nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.5.Xác định kháng nguyên bám dính của E.coli và Salmonella bằng phản ứng ng−ng kết trực tiếp hồng cầu (theo Jones Banner và cs, 1994 [91]).
ứng ng−ng kết trực tiếp hồng cầu (theo Jones Banner và cs, 1994 [91]).
- Chuẩn bị kháng nguyên trên môi tr−ờng đặc: giống vi khuẩn
Salmonella đ−ợc ria cấy trên môi tr−ờng thạch đĩa, bồi d−ỡng ở 370C trong 24 giờ. Sau đó, rửa mặt thạch bằng n−ớc muối sinh lí, thu lấy huyễn dịch vi khuẩn. Pha huyễn dịch để có độ pha loãng 5 x 108 vi khuẩn/1ml, bảo quản vi khuẩn đã pha ở 40C.
- Máu gà hay máu chuột lang đ−ợc lấy vào bình đã có sẵn citratnatri. Dùng dung dịch PBS rửa hồng cầu 3 lần bằng cách li tâm 2.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Sau lần rửa thứ 3 bỏ n−ớc, giữ lại hồng cầu và bảo quản ở nhiệt độ 40C. Khi làm phản ứng pha hồng cầu ở nồng độ 3% trong dung dịch P.B.S.
Chuẩn bị khay nhựa 96 lỗ, đáy chữ U, micropipet, dung dịch PBS, n−ớc muối sinh lí và các dụng cụ khác.
Phản ứng đ−ợc tiến hành trên khay nhựa 96 lỗ:
- Dùng micropipet nhỏ vào mỗi lỗ của khay nhựa 0,025ml n−ớc muối sinh lí.
- Để lại một dãy để làm đối chứng.
- Pha loãng huyễn dịch vi trùng đã chuẩn bị trên theo hệ số 2: 1/2, 1/4, 1/8…1/128.
- Thể tích sau khi pha loãng 0,025ml ở mỗi lỗ nhỏ. Lô đối chứng nhỏ 0,025 ml n−ớc muối sinh lí.
- Dùng micropipet nhỏ vào mỗi lỗ 0,025ml dung dịch hồng cầu gà hoặc chuột lang đã chuẩn bị ở trên.
- Lắc khay nhựa, đậy kín để ở 40C. - Đọc kĩ kết quả sau 2-6 giờ
Phản ứng d−ơng tính: Khi có hiện t−ợng ng−ng kết thì hồng cầu phủ khắp đãy lỗ khay. Đánh giá mức độ ng−ng kết.
(+): Hồng cầu ng−ng kết 25%, còn lắng cặn ở d−ới. (++): Hồng cầu ng−ng kết 5%, còn lắng đọng ở d−ới. (+++): Hồng cầu ng−ng kết 75% còn lắng đọng ở d−ới. (++++): Hồng cầu ng−ng kết 100%.
- Phản ứng âm tính: tất cả hồng cầu lắng ở đáy của lỗ khay nhựa thành cục tròn, giống lỗ đối chứng.